芪藶強心膠囊對壓力超負荷致慢性心衰大鼠的作用及機理研究

孫 鑫，許靜靜，陳 偉△

(1.上海中醫藥大學 附屬龍華醫院ICU，上海 200032;2.安徽中醫學院第一附屬醫院 醫療質量管理科，安徽 合肥 230031)

芪藶強心膠囊對壓力超負荷致慢性心衰大鼠的作用及機理研究

孫 鑫1，許靜靜2，陳 偉1△

(1.上海中醫藥大學 附屬龍華醫院ICU，上海 200032;2.安徽中醫學院第一附屬醫院 醫療質量管理科，安徽 合肥 230031)

目的:探討壓力超負荷致慢性心衰大鼠的心臟構型、心臟功能、細胞因子的變化及相互關系。觀察中藥芪藶強心膠囊對慢性心衰大鼠心室重構和心功能的影響及其可能的作用分子機制。方法:采用腹主動脈縮窄法，將70只雄性Wistar大鼠造模，6周后將模型大鼠隨機分為假手術組、手術模型組、纈沙坦組、芪藶強心膠囊低、中、高劑量組6組，灌服給藥時間為6周。治療后用測定大鼠心臟質量、血流動力學、心肌膠原含量的相關指標，同時應用放免法測定血漿及心肌組織中的血管緊張素Ⅱ的濃度，免疫印跡(Western blot)法檢測心肌CaN蛋白表達。結果:服藥6周后與假手術組比較，手術組大鼠心系數、左室重量指數、左心室收縮壓和舒張壓、羥輔氨酸含量、AngⅡ濃度和CaN蛋白表達均明顯增高，差異顯著(P<0.05);與手術模型組比較，芪藶膠囊各劑量組心系數、左室重量指數、左心室收縮壓和舒張壓、羥輔氨酸含量、AngⅡ濃度和 CaN蛋白表達均明顯降低，統計學有顯著差異(P<0.05);與纈沙坦組比較，芪藶中、高劑量組各項指標差異不顯著(P>0.05)。結論:芪藶強心膠囊可以減輕心衰大鼠的心室肥厚，抑制心肌纖維化和改善心功能。通過抑制RAS介導的鈣調神經磷酸酶(CaN)致心肌肥大作用可能是芪藶強心膠囊抑制慢性心衰進程的機制之一。

芪藶強心膠囊;慢性心衰;血管緊張素Ⅱ;CaN信號通路

近年來，隨著我國人口老齡化和高血壓、冠心病發病率的上升和群體的擴大，心力衰竭作為多種心血管系統疾病的終末階段，已成為導致死亡的主要原因之一。各種原發病導致慢性心力衰竭的共同病理基礎是心室重構。心室重構包括心肌細胞的肥大、凋亡和間質的纖維化［1］。近期研究發現，過渡激活的RAS系統造成循環和心肌局部 AngⅡ濃度增加，誘導Ca2+活化的、CaN依賴的信號轉導通路在心室重構直至心力衰竭的發生發展中起到重要作用［2、3］。

本研究采用腹主動脈縮窄法建立慢性心衰大鼠模型，根據中醫理論對于慢性心衰“心腎陽虛為本，血瘀水泛為標”的病因病機認識，應用以益氣溫陽、活血利水法組方的芪藶強心膠囊干預實驗性慢性心衰大鼠模型，通過觀察其對心衰大鼠心臟結構、心肌膠原含量、心功能、AngⅡ濃度和CaN表達等方面的影響，探究其干預心室重構及治療心衰的作用及可能的分子機制。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

70只 9周齡 Wister雄性大鼠，SPF級，體重210g±10g，用3%戊巴比妥鈉溶液全麻下行腹主動脈縮窄術，造摸后6周進行血流動力學檢測和病理形態學觀察，鑒定慢性心衰模型成功與否。

1.2 使用藥品和儀器

纈沙坦膠囊(代文)由北京諾華制藥有限公司生產，產品批號 x0371，配制成 80mg/100ml溶液。芪藶強心膠囊干膏粉制劑由河北以嶺制藥公司，生產批號 20070526，配制成 7.68g干膏粉/100ml、15.36g干膏粉/100ml、30.72g干膏粉/100ml 3種濃度。羥脯氨酸試劑盒、AngⅡ放射免疫分析藥盒、細胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質定量試劑盒、埃德多導電生理儀、2021C型紫外分光光度計、SN-695A智能放免Y測量儀等。

1.3 治療方法

將模型大鼠隨機分為假手術組、手術模型組、纈沙坦組、芪藶強心膠囊低、中、高劑量組6組。第7周開始進行灌胃，假手術組和手術模型組灌服生理鹽水2.5ml/d，纈沙坦組劑量為6.38mg/kg/d，芪藶強心膠囊低劑量為0.64g干膏粉/kg/d，中劑量為:1.28g干膏粉/kg/d，高劑量為2.56g干膏粉/kg/d，以上各治療組均按照每次灌服2.5ml量用雙蒸水配制成藥液，每日1次，灌服6周。

1.4 心臟血流動力學的測定

用3%戊巴比妥鈉溶液按照30mg/kg劑量腹腔注射麻醉，在右頸總動脈做一下斜行切口，插入充滿肝素生理鹽水的PE-50聚乙烯導管，緩緩插入至心室腔，記錄穩定波形。利用Powerlab軟件計算波形得到 HR、LVSP、LVEDP、+/－dp/dtmax等指標數據。

1.5 心系數、左室質量指數的測定

測完血流動力學指標及腹主動脈取血后，進行分離心臟，稱全心重紀錄，再分離左心室稱重記錄，計算全心重(g)/體重(kg)為心系數，左心室重(g)/體重(kg)為左室質量指數。

1.6 心肌組織羥脯氨酸含量的測定

采用比色法測定。先將心肌組織稱重、水解，置于干凈試管中，按照羥脯氨酸試劑盒步驟配制各溶液，依次加樣最后測定其吸光度，根據公式:羥脯氨酸(μg/mg濕重)=(測定管吸光度 －空白管吸光度)/(標準管吸光度 －空白管吸光度)×標準品(5μg/ml)×水解液總體積(5ml)/組織濕重(mg)，計算得出心肌的羥脯氨酸含量。

1.7 血漿及心肌組織AngⅡ濃度的測定

采用核放射免疫測定法。將大鼠血漿置于室溫中復融混勻，低溫離心后取上清測定;而心肌組織經過稱重、碾磨水浴、勻漿、低溫離心后，取上清液測定。根據試劑盒步驟依次添加試劑溶液，混勻靜置后離心，吸上清液，測定各管沉淀的放射性計數(cpm)。根據軟件及公式計算出大鼠血漿和心肌組織中的AngⅡ濃度。

1.8 心肌CaN蛋白表達量的檢測

采用免疫印跡(Western blot)法檢測。先將心肌組織勻漿進行蛋白提取定量，超聲波破細胞，吸取上清液，經過 SDS-PAGE電泳、轉膜進行免疫測定，X線顯影后拍片看條帶寬度和密度。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 一般情況

假手術組大鼠反應靈敏，活動良好，進食活躍、體重明顯增長;模型組造摸6周，體重略有上升，而到12周飲食、活動明顯減少，肢體頭面部浮腫;各治療組飲食活動較假手術組有減少，體重略有下降，癥狀相對模型組較輕。

表1 各組大鼠心系數、心室質量指數的變化(±s，n=8)

表1 各組大鼠心系數、心室質量指數的變化(±s，n=8)

注:與假手術組比較:*P<0.05;與手術模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別心系數 左室重量指數假 手 術 組2.68±0.14 1.83±0.08手 術 模 型 組 3.48±0.34* 2.36±0.22*纈 沙 坦 組 2.89±0.66 △ 1.92±0.13△中藥低劑量組 3.09±0.27 △ 2.23±0.09 △□中藥中劑量組 2.94±0.15 △ 2.02±0.13 △中藥高劑量組 2.96±0.10 △ 1.99±0.09 △

2.2 大鼠心肌肥厚指標

與假手術組比較，模型組大鼠心系數、左室重量指數明顯增大，有顯著差異(P<0.01);與模型組比較，各治療組心系數、左室重量指數均有減小，差異明顯(P<0.05);與纈沙坦組比較，中藥各治療組心系數、左室重量指數均有增大，但差異不顯著(P<0.05);中藥各治療組組間比較差異不明顯，無統計學意義(P>0.05)。

2.3 大鼠心功能改變

與假手術組比較，模型組大鼠心率明顯加快，LVSP和+dp/dtmax明顯降低，差異顯著(P<0.05);－dp/dtmax明顯降低，LVEDP顯著升高，差異明顯(P<0.05);與模型組相比，纈沙坦組心率較慢，LVSP和+dp/dtmax升高明顯，LVEDP明顯降低(P<0.05)，中藥各劑量組心率較模型組均較慢，LVSP在中、高劑量組明顯升高，LVEDP高劑量組降低明顯，+dp/dtmax中藥各劑量組均明顯升高，－dp/dtmax高劑量組升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05);與纈沙坦組比較，中藥低劑量組心率較快、LVSP較低，差異顯著(P<0.05)，而中、高劑量組則無差異(P>0.05);中藥各組LVEDP較纈沙坦組均增高(P<0.05);+dp/dtmax中藥低劑量組均明顯降低(P<0.05)，中、高劑量組則無顯著差異(P>0.05);－dp/dtmax中藥低、中劑量組均降低(P<0.05)，高劑量組有降低，但差異不顯著，無統計學意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠左心收縮功能的比較(±s)

表2 各組大鼠左心收縮功能的比較(±s)

注:與假手術組比較:*P<0.05;與手術模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別 n HR(min－1)LVSP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg·s －1)假 手 術 組8 396.87±9.03 168.75±12.10 7368.88±245.69手 術 模 型 組 7 428.42±8.42* 134.71±5.82* 5795.43±396.75*纈 沙 坦 組 7 408.43±8.36 △ 156.71±6.47 △ 6827.00±263.23 △中藥 低 劑 量 組 6 421.83±8.13 △□141.00±9.63 □ 6238.33±192.63 △□中藥 中 劑 量 組 7 410.00±9.18 △ 146.71±7.59 △ 6532.29±336.61 △中藥 高 劑 量 組 6 403.83±9.09△ 152.33±8.64 △ 6755.67±264.26 △

表3 各組大鼠左心舒張功能的比較(±s)

表3 各組大鼠左心舒張功能的比較(±s)

注:與假手術組比較:*P<0.05;與手術模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別 n LVEDP(mmHg)－dp/dtmax(mmHg·s－1)假 手 術 組8 4.40±0.95 6416.13±273.87手 術 模 型 組 7 14.91±1.80* 5489.57±293.97*纈 沙 坦 組 7 7.63±1.76 △ 6019.00±173.49 △中藥 低 劑 量 組 6 13.38±2.47 □ 5611.33±362.44 □中藥 中 劑 量 組 7 12.96±2.42 □ 5694.86±169.95 □中藥 高 劑 量 組 6 11.60±1.16 △□ 5935.67±103.54 △

2.4 心肌纖維化指標

與假手術組比較，模型組大鼠心肌羥脯氨酸含量明顯升高，差異有顯著統計學意義(P<0.01);與模型組相比，各治療組大鼠心肌羥脯氨酸含量均有明顯減少，差異具有顯著統計學意義(P<0.01);中藥中劑量組與纈沙坦組及中藥中、高劑量組比較，大鼠心肌羥脯氨酸含量亦明顯減少，差異具有統計學有意義(P<0.05)。

2.5 RAS系統的變化

與假手術組比較，模型組大鼠血漿AngⅡ濃度明顯升高(P<0.01);與模型組比較，纈沙坦組血漿AngⅡ濃度亦增高(P<0.05);中藥各劑量組較模型組AngⅡ濃度均有下降，而中劑量組下降顯著;與纈沙坦組比較，中藥各劑量組AngⅡ濃度均明顯降低，差異顯著(P<0.05)。

與假手術組比較，模型組心肌AngⅡ濃度顯著增高(P<0.01);與手術模型組比較，西藥組心肌AngⅡ含量明顯降低(P<0.05)，中藥各組均有下降，中、高劑量組 AngⅡ含量下降顯著(P<0.05)。說明纈沙坦對局部AngⅡ的分泌有抑制作用，而中藥中、高劑量組也具有明顯降低心肌局部AngⅡ分泌的作用，與纈沙坦組間比較無顯著差異(P>0.05)。

表4 各組大鼠心肌羥脯氨酸含量的比較(±s，n=8)

表4 各組大鼠心肌羥脯氨酸含量的比較(±s，n=8)

注:與假手術組比較:*P<0.05;與手術模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別羥脯氨酸含量(μg/mg)假 手 術 組0.27±0.01手 術 模 型 組 0.47±0.08*纈 沙 坦 組 0.33±0.03 △中藥低劑量組 0.33±0.03 △中藥中劑量組 0.28±0.03△□中藥高劑量組 0.33±0.07 △

表5 各組大鼠血漿中AngⅡ濃度的比較(±s，n=6)

表5 各組大鼠血漿中AngⅡ濃度的比較(±s，n=6)

注:與假手術組比較:*P<0.05;與手術模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別 心肌AngⅡ(pg/g) 血漿AngⅡ(pg/ml)假 手 術 組587.67±52.27 275.37±40.22手 術 模 型 組 738.68±37.68* 400.75±40.04*纈 沙 坦 組 653.76±36.04△ 469.35±56.08 △中藥 低 劑 量 組 723.11±21.07 □ 357.16±55.78 □中藥 中 劑 量 組 672.49±28.02 △ 327.83±41.73 △□中藥 高 劑 量 組 668.42±34.57 △ 352.54±63.73 □

2.6 CaN蛋白表達

與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織CaN蛋白表達量顯著增高，差異具有顯著統計學意義(P<0.01);與手術模型組相比，纈沙坦組和中藥各劑量組大鼠心肌CaN蛋白表達量均降低，差異有顯著統計學意義(P<0.01);而與纈沙坦組相比，中藥各劑量組CaN蛋白表達量均有相對增高，但差異不顯著，無統計學意義(P>0.05)。

表6 CaN蛋白表達量(±s，n=6)

表6 CaN蛋白表達量(±s，n=6)

注:與假手術組比較:*P<0.05;與手術模型組比較:△P<0.05;與纈沙坦組比較:□P<0.05

組別CaN 的量假 手 術 組7.59±1.09手 術 模 型 組 17.08±2.26*纈 沙 坦 組 9.08±1.73△中藥低劑量組 11.13±2.82 △中藥中劑量組 10.17±1.19 △中藥高劑量組 10.80±1.67 △

3 討論

心力衰竭是多種心血管系統疾病的嚴重階段，而各種原發病導致心力衰竭的共同病理基礎便是心室重構，主要表現為心肌肥厚、間質纖維化、神經體液因子的變化及發生在分子水平的變化。因此，心力衰竭的治療方向是阻斷衰竭的心肌重塑，干預心肌細胞內的分子生物學機制［4］。

研究表明，過度激活的腎素-血管緊張素系統(RAS系統)是發生心室重構重要的機制之一，其效應物AngⅡ可以引起一系列的后續效應，激活相關信號轉到通路，其中一條“Ca2+/鈣調素→CaN→NFAT3→心肌細胞肥大基因表達→心肌細胞肥大”的信號通路，其在心肌肥大直至心衰的發生發展中起到重要作用［5、6］。

中醫學對慢性心衰病因病機的認識，是在正氣內虛的基礎上，感受外邪，傷及心脾腎陽氣，使氣滯血瘀、水氣不化、血瘀水泛、上凌心肺、外溢肌膚所致，即本病為本虛標實之證。本虛為氣虛、陽虛，標實為血瘀、水濕、痰飲。而益氣溫陽、活血化瘀、瀉肺利水成為治療慢性心衰的主要原則［7、8］。

本實驗研究中，采用以益氣溫陽、活血利水法組方的芪藶強心膠囊，發現它能夠減少心衰大鼠的心系數和左室質量指數，其中以中、高劑量組作用較明顯(P<0.05);能夠降低心衰大鼠心肌組織中羥脯氨酸的含量(P<0.05)，其中以中劑量組效用較佳;能夠提高慢性心衰大鼠模型LVSP和+/－dp/dtmax的水平，并降低 LVEDP的水平 (P<0.05)，對大鼠的收縮功能和舒張功能均有一定的影響;可以降低大鼠循環及心肌組織中 AngⅡ濃度(P<0.05)，提示其治療慢性心衰的作用可能與抑制激活的RAS系統相關;可以降低心肌中CaN的蛋白表達，提示其對鈣調神經磷酸酶(CaN)信號通路具有一定的抑制效應。結果提示，芪藶強心膠囊可以明顯逆轉心室肥厚、抑制心肌纖維化和改善心功能;通過抑制RAS介導的鈣調神經磷酸酶(CaN)信號通路而致心肌肥大作用可能是芪藶強心膠囊抑制慢性心衰進程的分子機制之一。

［1］楊水祥，胡大一.心力衰竭的新機制和新策略研究進展［J］.中國心血管病研究雜志，2005，3(6):17-21.

［2］WollertK，DrexlerH. The rennin-angiotensin system and experimental heart failure［J］.Cardiovasc Res，1999，43(4):839-849.

［3］符民桂.鈣調神經磷酸酶依賴的信號通路在大鼠心肌肥大中的作用及調節［J］.生理科學進展，2001，32(1):52-53.

［4］盛瑞，顧振綸.超負荷心肌肥厚心肌細胞的凋亡和增殖［J］.中國藥理學通報，2005，21(5):531-535.

［5］GiancarloGon alves，Leonardo A. M. Blockade ofRenin-Angiotensin System AttenuatesCardiac Remodeling in Rats Undergoing Aortic Stenosis［J］.Arquivos Brasileiros de Cardiologia，2005，24(4).

［6］張鑫，楊永健.纈沙坦對壓力負荷心肌肥大鈣調神經磷酸酶(CaN)通路的作用［J］. 高血壓雜志，2005，13(6):358.

［7］王大英，李勇.中藥干預心室重構的可能機制探討［J］.中西醫結合雜志，2004，24(6):12-14.

［8］鄒國輝，劉中勇，等.中醫對心力衰竭心室重構的認識［J］.江西中醫藥，2006，37(281):11-12.

△通訊作者

R285.5

B

1006-3250(2010)07-0560-03

2010-01-20