替米沙坦抑制SHR大鼠心肌Smad2、3蛋白表達及減輕心肌纖維化作用的研究

曲 巍，于 波

（中國醫科大學附屬第一臨床學院心內科，遼寧沈陽 110001）

替米沙坦抑制SHR大鼠心肌Smad2、3蛋白表達及減輕心肌纖維化作用的研究

曲 巍，于 波*

（中國醫科大學附屬第一臨床學院心內科，遼寧沈陽 110001）

目的：探討替米沙坦對自發性高血壓大鼠(SHR)心肌纖維化的抑制作用，及心肌Smad2、3蛋白表達的影響。方法：將20只雄性SHR大鼠隨機分為兩組，分別為替米沙坦組和對照組。分別給予替米沙坦10 mg/(kg·d)，對照組二甲亞砜1 ml/d灌胃，共8周。于實驗前、2周、8周，應用尾套法測血壓3次。8周后分離血漿檢測血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）水平。心肌石蠟切片通過免疫組化法測定Smad2、3蛋白和Ⅰ型膠原的表達。結果：灌胃8周后，與對照組相比，替米沙坦組AngⅡ水平明顯升高（P<0.05）；Smad2、3蛋白和Ⅰ型膠原的表達明顯降低（P均<0.05）。結論：替米沙坦能抑制心肌纖維化，這一作用可能部分通過抑制Smad2、3蛋白表達來實現。

替米沙坦；心肌纖維化；Smad2、3蛋白

心肌纖維化（myocardial fibrosis,MF）是多種心臟疾病發展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構的主要表現之一。這種病理變化在多種心血管疾病中存在，與心律失常、心力衰竭密切相關。MF是高血壓左室重構的主要表現之一[1]。表現為細胞外基質合成與降解之間失衡。間質中膠原沉積增多，各種膠原比例失調（Ⅰ/Ⅲ型膠原比率增加）的排列紊亂。業已證實，在影響MF的諸多因素中，腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）激活，AngⅡ水平增高是導致MF的主要原因。AngⅡ通過AT1受體介導機制調節心肌細胞中TGF-β1形成。TGF-β/Smads信號轉導通路是TGF-β發揮生物學作用的主要通路，其分子組成與分子調節復雜，與其他信號通路存在廣泛交互影響，對心肌纖維化的發生和發展有明確作用[2]。Smads蛋白分為 3 種，受體調節蛋白 Smad2、3，通用蛋白Smad4和抑制蛋白Smad6與Smad7。

而血管緊張素受體拮抗劑（ARB），雖然使AngⅡ水平增高，但也能抑制MF,其作用機制是一方面抑制AT1受體，另一方面過度激活AT2受體。本研究通過其抑制Smad 2、3，膠原蛋白Ⅰ的表達，進一步證實其抑制心肌纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

替米沙坦原料藥購自武漢富馳生物科技有限公司。兔抗大鼠Smad2、3抗體、兔抗大鼠Ⅰ型膠原抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。鼠AngⅡ放免試劑盒購自北京北方生物技術研究所。

1.2 動物及分組

SHR雄性大鼠20只購自北京維通利華公司，體重200 g左右。將實驗動物隨機分為兩組：①替米沙坦組，10只，給予替米沙坦10 mg/(kg·d)灌胃8周；②對照組，10只，給予等量溶劑二甲亞砜1 ml/d灌胃，共8周。

1.3 方法

1.3.1 實驗前、2周后、第8周處死動物前，測大鼠血壓：應用尾套法測定大鼠尾動脈收縮壓，配以大鼠尾容積脈搏波動的聲光顯示。測量血壓前大鼠預置于38～40℃室溫20 min，使尾動脈充分擴張后，將鼠尾套于壓敏傳感器上。捏水銀檢壓計氣球，向尾套氣囊內充氣，指導容積脈搏消失，再緩慢放氣，當再聽到規律聲音時，血壓表所指刻度為尾動脈收縮壓。連續測3次，取平均值。

1.3.2 8 周后取血處死動物：10%水合氯醛0.03 ml/kg腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血8～10 ml處死大鼠。分離血清用放射免疫的方法檢測AngⅡ水平。

1.3.3 大體心臟標本計算左室相對重量、左室截面直徑：①心室重量及心室重量指數的測定待血流動力學指標測定完成后，迅速打開胸腔摘取心臟，在冰生理鹽水中洗去血液，去除心室周圍組織，用電子天平(精確到0.01 mg)稱取心室重量(HW)，分別與體重相除，計算心室重量指數(VWI：HW/體重)。②左室截面直徑的測定參照張沛等[3]的方法測量，測完心臟重量后，迅速置于4%多聚甲醛固定液固定心肌組織。固定1周后，于長軸中點垂直橫切心臟，直接法測量左室腔內徑(D)，即分別測定最短徑(DAMIN)和最長徑(DMAN)，取其幾何平均值。

1.3.4 測定血漿AngⅡ水平：腹主動脈取血至少2 ml制備血漿（EDTA-Na2抗凝），采用放射免疫法測定。

1.3.5 SHR大鼠心肌Smad2、3蛋白和Ⅰ型膠原的表達：取心肌石蠟切片行Smad2、3蛋白和Ⅰ型膠原的免疫組化法測定。一抗為Smad2、3蛋白和Ⅰ型膠原抗體，PBS緩沖液代替一抗作為空白對照，根據ABC法試劑盒進行操作，DAB顯色。顯微鏡下400倍觀察，陽性表達呈棕黃色。

1.4 統計學分析

用SPSS 11.0軟件進行統計學處理。數據以均數±標準差表示，組間進行重復測量資料的方差分析。等級資料用秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 替米沙坦對血壓的影響

見表1。

表1 實驗前、2周、8周血壓值(±s,mmHg)

表1 實驗前、2周、8周血壓值(±s,mmHg)

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替米沙坦組8周血壓值較實驗前下降，與對照組實驗前后相比，血壓值更低（P均<0.05）。

2.2 大體心臟標本計算左室相對重量、左室截面直徑的結果

見表2。

表2 左室相對重量、左室截面直徑(±s)

表2 左室相對重量、左室截面直徑(±s)

替米沙坦組對照組組別 左室相對重量（10-3） 左室截面直徑(mm)2.240±0.214 2.812±0.330 11.38±0.54 12.23±0.61

替米沙坦組的左室相對重量、左室截面直徑都小于對照組（P 均<0.05）。

2.3 血漿AngⅡ水平的結果

替米沙坦組AngⅡ水平（ng/L）高于對照組[(1 124.5±8.13)vs(726.5±5.72)，P<0.05]。

2.4 替米沙坦對SHR大鼠心肌Ⅰ型膠原、Smad2、3蛋白表達的影響

顯微鏡400倍下觀察結果，全部視野陽性染色 <10%為（-）；10%～25%為（+）；26%～50%為（++）；51%～75%為（+++）；>75%為（++++）。8周后，免疫組化染色顯示，Ⅰ型膠原在肌束間隙及細胞間隙成束排列。與對照組相比，替米沙坦組Ⅰ型膠原表達明顯減少（圖 1、2）（P<0.05）。 Smad2、3 蛋白為主要分布于胞質中的棕黃色顆粒。與對照組相比，替米沙坦組Smad2、3 蛋白表達明顯減少（圖 3、4）（P<0.05）。

3 討論

TGF-β1在MF中起重要作用，同時作為一個強有力的調節因子，它的作用通過TGF-β1/Smads信號轉導通路來實現。近年來心肌梗死后Smad信號被激活的研究比較多。心肌梗死后TGF-β激活Smad信號，促進成纖維細胞增殖，前膠原蛋白Ⅰ和纖維連接蛋白（FN）合成，抑制細胞外基質降解[4]；激活誘導細胞凋亡的蛋白激酶[5]。Ghosh-Choudhury也證實Smads在心肌細胞凋亡過程中起到信號轉導作用[6]。ARB能減弱TGF-β和Smad的活性，從而減輕再灌注心肌的纖維病變。保護心肌梗死后心肌細胞的功能[7]。

而對于高血壓引起心肌纖維化過程中，Smad2、3的作用及血管緊張素受體拮抗劑的作用研究較少。隨著ONTARGET及NAVIGATOR研究結果的公布，血管緊張素受體拮抗劑的表現不盡如人意。甚至NAVIGATOR研究結果顯示，纈沙坦與安慰劑相比不能帶來更多的心血管獲益。在這樣的困惑中，需要更多與ARB相關的基礎研究。

本研究表明，替米沙坦能抑制Ⅰ型膠原的生成，抑制Smad2、3誘導的心肌纖維化，在SHR大鼠的心肌纖維化過程中起到明顯的心肌保護作用。這個結果是否明確，還需進一步的研究反復證實。替米沙坦的研究結果能否推廣到所有ARB，還需更多的研究和努力。

[1]Treasure CB,Klein JL,Weintraub WS,et al.Beneficial effects of cholesterol-lowering therapy on the coronary endothelium in patients with coronary artery disease[J].N Engl J Med,1995,332(8):481.

[2]張海嘯,史載祥.轉化生長因子-β信號傳導通路與心肌纖維化[J].中日友好醫院學報,2007,21(2):110-112.

[3]張沛,楊躍進,宋來鳳,等.小劑量依那普利對大鼠急性心肌梗死左室重構和功能的影響[J].中華老年心腦血管病雜志,2000,2(3):40-41.

[4]Wang B,Omar A,Angelovska T,et al.Regulation of collagen synt hesis by inhibitory Smad7 in cardiac myofibroblasts[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(2):1282-1290.

[5]Chipuk JE,Bhat M,Hsing AY,et al.Bcl-xL blockst ransforming growt h factor-beta 1-induced apoptosis by inhibiting cytochrome c release and not by directly antagonizing Apaf-1-dependent caspase activation in prostate epit helial cells[J].J Biol Chem,2001,276(28):26614-26621.

[6]肖健,王志農.Smads在心肌細胞凋亡過程中的信號轉導[J].生理科學進展,2009,40(2):185-187.

[7]Euler-Taimor G,Heger J.The complex pat tern of SMAD signaling in t he cardiovascular system[J].Cardiovasc Res,2006,69(1):15-25.

Telmisartan inhibited protein Smad2,3 expression and reduced myocardial fibrotic remodeling in SHR

QU Wei,YU Bo*
(Department of Cardiology,First Affilated Hospital of China Medical University,Liaoning Province,Shenyang 110001,China)

Objective:To explore the effects of telmisartan on myocardical fibrotic remodeling and involvement of protein Smad2,3 expression.Methods:Twenty male SHR were randomly divided into 2 groups,telmisartan group and comparative group.Telmisartan group were poured telmisartan 10 mg/(kg·d);comparative group were poured dimethyl sulfoxide 1 ml/d in stomach.Before,after two weeks and 8 weeks treatment,the blood pressure were measured by tail-sleeve method.At week 8,the levels of AngⅡin plasma were measured by radioimmunoassay kit.After week 8,the protein levels of Smad2,3 and collagenⅠwere assayed by angiography and histomorphometric analysis.Results:Following 8 weeks treatment,telmisartan group displayed a significant elevation in the levels of AngⅡ,P<0.05,and reduction in Smad2,3 and collagenⅠ(P<0.05 respectively).Conclusion:Telmisartan attenuates myocardical collagen synthesis in SHR possibly through downregulating the expression of Smad2,3.

Telmisartan;Myocardial fibrosis;Smad2,3

R-332

A

1674-4721（2010）09（a）-021－03

*通訊作者

2010-08-02）