乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦乳汁的HBV-DNA研究

朱云霞 ，張 華 ，鄒懷賓 ，柳 鑫 ，李 卓 ，陳 煜 ，段鐘平

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心，北京 100069）

乙肝病毒攜帶產(chǎn)婦乳汁的HBV-DNA研究

朱云霞1，張 華1，鄒懷賓2，柳 鑫1，李 卓1，陳 煜2，段鐘平2

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心，北京 100069）

目的：研究HBV攜帶產(chǎn)婦血清、乳汁及臍血中的HBV-DNA含量與其血清HBV標(biāo)志物之間的關(guān)系，探討HBV攜帶產(chǎn)婦乳汁的傳染性。方法：對(duì)207例HBV攜帶產(chǎn)婦，采用電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)產(chǎn)婦的乙肝五項(xiàng)及采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HBV攜帶產(chǎn)婦血清、乳汁及臍血中的HBV-DNA含量。結(jié)果：125例HBsAg和HBeAg雙陽(yáng)性的產(chǎn)婦，其乳汁HBV-DNA陽(yáng)性率為9.6%，82例HBsAg陽(yáng)性但HBeAg陰性的產(chǎn)婦，其乳汁HBV-DNA陽(yáng)性率為2.4%。兩組乳汁HBV-DNA陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.027，P=0.045)；血清HBV-DNA<106copies/ml的產(chǎn)婦其產(chǎn)婦乳汁及臍血中HBV-DNA均為陰性。血清HBV-DNA≥106copies/ml的產(chǎn)婦其乳汁HBV-DNA陽(yáng)性率為12.5%、其新生兒臍血陽(yáng)性率為15.17%，與血清HBV-DNA<106copies/ml的產(chǎn)婦相比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.001）。結(jié)論：對(duì)于HBsAg陽(yáng)性的產(chǎn)婦，HBsAg和HBeAg雙陽(yáng)性的產(chǎn)婦乳汁傳染性高于HBsAg單陽(yáng)性的產(chǎn)婦，血清HBVDNA≥106copies/ml的產(chǎn)婦乳汁傳染性高于血清HBV-DNA<106copies/ml的產(chǎn)婦。

肝炎病毒；乙型；臍血；母嬰傳播；乳汁

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染目前仍是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]，乙型肝炎病毒核酸基因（HBVDNA）是反映HBV復(fù)制及傳染性的直接指標(biāo)，母嬰傳播是乙肝病毒的主要傳播途徑之一，關(guān)于產(chǎn)后母乳喂養(yǎng)是否引起HBV感染的重要因素的研究已受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注[2-4]。本文對(duì)207例（2007年6月～2008年1月）在本院分娩并自愿參加此次臨床研究的的HBV攜帶產(chǎn)婦的血清、乳汁及新生兒臍血血清進(jìn)行HBV-DNA定量檢測(cè)，對(duì)HBV攜帶產(chǎn)婦乳汁的傳染性進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

207例HBV攜帶產(chǎn)婦為2007年6月～2008年1月在本院分娩并自愿參加此次臨床研究的產(chǎn)婦,年齡19～39歲,平均28.6歲，肝功能丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）均正常，無(wú)其他并發(fā)癥。

1.2 標(biāo)本采集及處理

1.2.1 孕婦外周血收集 所有檢測(cè)對(duì)象均抽取靜脈血3 ml注入試管，靜置60 min，以3 000 r/min，離心20 min，分離血清，-80℃保存待檢測(cè)HBV-M和HBV-DNA。

1.2.2 新生兒臍帶血標(biāo)本收集 陰道分娩或剖宮產(chǎn)術(shù)中，胎兒娩出斷臍后，用2%碘酒消毒臍帶，5 ml無(wú)菌注射器抽取3 ml臍動(dòng)脈血，注入試管后送檢。靜置60 min，以3 000 r/min，離心20 min，分離血清，-80℃保存待檢HBV-DNA。

1.2.3 乳汁標(biāo)本收集 乳汁采集于產(chǎn)婦分娩后3～5 d，乳房局部清洗消毒，用一次性無(wú)菌容器采取乳汁2 ml，10 000 r/min，離心5 min，留取沉淀物加入無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液1 ml混勻，10 000 r/min，離心5 min，吸干上清液（用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液洗滌沉淀物約3次），加入40 μl DNA提取液充分混勻100℃，10 min 10 000 r/min 離心 5 min， 吸取上清液 2 μl用于PCR反應(yīng)，待檢HBV-DNA。

1.3 檢測(cè)方法、試劑和主要儀器

母親乙肝五項(xiàng)均采用電化學(xué)發(fā)光方法，試劑購(gòu)自美國(guó)Abbott公司，儀器使用美國(guó)Abbott公司i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。

母親血清、乳汁及臍血的HBV-DNA定量采用熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)，試劑購(gòu)自上海科華生物公司，儀器采用Fluo-Cycle實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孕婦血清免疫學(xué)指標(biāo)與乳汁HBV-DNA陽(yáng)性的關(guān)系

HBsAg和HBeAg雙陽(yáng)性組產(chǎn)婦與HBsAg陽(yáng)性但HBeAg陰性組產(chǎn)婦乳汁HBV-DNA陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045），見(jiàn)表 1。

表2 孕婦血清HBV-DNA病毒載量與乳汁及新生兒臍血HBV-DNA陽(yáng)性的關(guān)系

表1 產(chǎn)婦血清免疫學(xué)指標(biāo)與乳汁HBV-DNA陽(yáng)性的關(guān)系

2.2 產(chǎn)婦血清HBV-DNA病毒載量與乳汁及新生兒臍血HBV-DNA陽(yáng)性的關(guān)系

207例產(chǎn)婦血清HBV-DNA<106copies/ml 95例，其產(chǎn)婦乳汁及新生兒臍血中檢出HBV-DNA均為陰性。產(chǎn)婦血清HBV-DNA≥106copies/ml為112例，其產(chǎn)婦乳汁HBV-DNA陽(yáng)性14例，乳汁HBV-DNA陽(yáng)性率為12.5%，其中106水平有2例，107水平有2例，108水平有9例，109水平有1例。血清HBV-DNA≥106copies/ml組產(chǎn)婦與HBV-DNA<106copies/ml組產(chǎn)婦乳汁HBV-DNA陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。產(chǎn)婦血清HBV-DNA≥106copies/ml其新生兒臍血中檢出HBV-DNA陽(yáng)性17例，HBV-DNA陽(yáng)性率為15.17%。血清HBV-DNA≥106copies/ml組產(chǎn)婦與HBV-DNA<106copies/ml組產(chǎn)婦所分泌嬰兒的臍血HBV-DNA陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），見(jiàn)表 2。

3 討論

當(dāng)今學(xué)術(shù)界認(rèn)為HBV母嬰傳播主要的途徑有3個(gè)，①宮內(nèi)感染：HBV在胎盤(pán)內(nèi)復(fù)制經(jīng)血和（或）細(xì)胞傳遞是HBV宮內(nèi)傳播的主要途徑。其傳播的機(jī)制可能為，當(dāng)HBV感染胎盤(pán)后，由HBsAg介導(dǎo)的免疫復(fù)合物反應(yīng)使部分絨毛纖維素樣壞死，通透性增加，導(dǎo)致病毒穿透胎盤(pán)屏障感染胎兒。②產(chǎn)道感染：當(dāng)母體帶有大量乙肝病毒時(shí)，乙肝病毒可通過(guò)宮內(nèi)傳播或分娩時(shí)胎兒吸入受污染的羊水、血及陰道分泌物或因微小的皮膚黏膜損傷致使含有HBV的母血進(jìn)入胎兒循環(huán)導(dǎo)致感染（產(chǎn)道感染），所以要重視產(chǎn)時(shí)傳播。③產(chǎn)后感染：眾所周知，母乳是嬰兒最理想的天然食品，但也可能是引起產(chǎn)后感染的重要因素。

金春子等[4]、羅世香等[5]報(bào)道，HBV攜帶者乳汁中檢出HBV-DNA，母乳喂養(yǎng)可能是傳播HBV的途徑之一。因?yàn)镠BV雖為嗜肝性病毒，但也侵犯其他細(xì)胞，淋巴細(xì)胞、精細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有HBV-DNA的整合[6]。由于早期的母乳中存有大量淋巴細(xì)胞，故不能排除HBV-DNA在母乳中整合和復(fù)制成HBV的可能性。當(dāng)新生兒或嬰兒消化道任何一處（口腔、咽、食道、胃、腸道）黏膜因炎癥發(fā)生水腫、滲出，導(dǎo)致通透性增加或黏膜直接破損時(shí)，母乳中的有害物質(zhì)就可能通過(guò)毛細(xì)血管網(wǎng)進(jìn)入血循環(huán)而引起乙肝感染。這種危險(xiǎn)性也存在于耳、鼻、面部有破損的溢奶嬰兒。

HBV-DNA是HBV的基因組成與復(fù)制模板，它的檢出是HBV感染的直接依據(jù)，也是衡量傳染性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)之一。因此，乳汁中HBV-DNA的濃度的高低與傳染風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：產(chǎn)婦血清HBV-DNA<106copies/ml時(shí)，其乳汁HBV-DNA為陰性，但當(dāng)產(chǎn)婦血清HBV-DNA≥106copies/ml時(shí)，其乳汁HBV-DNA陽(yáng)性率為12.5%。這一結(jié)果表明產(chǎn)婦血清HBV-DNA濃度≥106copies/ml時(shí)，乳汁具有傳染性的可能性較大，其分娩的嬰兒感染HBV的概率會(huì)增加，應(yīng)同時(shí)檢測(cè)乳汁HBV-DNA的結(jié)果，盡量避免哺乳。尤其是產(chǎn)婦血清和乳汁中HBV-DNA同時(shí)為陽(yáng)性，新生兒血清HBV-DNA陰性，而幸免宮內(nèi)感染，更應(yīng)避免哺乳，以便預(yù)防產(chǎn)后的母嬰傳播。對(duì)于HBeAg陰性而血液和乳汁HBV-DNA陰性的產(chǎn)婦，在其嬰兒接受主被動(dòng)聯(lián)合免疫后，乳汁具有傳染性的可能性較小，可在醫(yī)生的指導(dǎo)下考慮母乳喂養(yǎng)。高病毒載量的孕婦，新生兒臍血的病毒載量高。如果新生兒血清HBV-DNA陽(yáng)性，證明新生兒已被感染，則母乳喂養(yǎng)利大于弊。游泳等[7]研究證明，臍血HBV-M及HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果與新生兒靜脈血HBV-M及HBV-DNA檢測(cè)結(jié)果相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示采用臍血檢測(cè)了解胎兒宮內(nèi)是否受乙肝病毒感染是可行的。

本實(shí)驗(yàn)中，新生兒臍血中HBV-DNA總陽(yáng)性率為8.21%，產(chǎn)婦血清HBV-DNA濃度高者，其乳汁及臍血的陽(yáng)性率也明顯升高。所以，應(yīng)注意HBsAg陽(yáng)性婦女母乳喂養(yǎng)前應(yīng)檢測(cè)血HBV-DNA，復(fù)制活躍者應(yīng)考慮采取人工喂養(yǎng)措施，以盡量減少母嬰傳播的危險(xiǎn)。由于HBV在產(chǎn)婦的初乳中即可能排出，這對(duì)從新生兒起預(yù)防HBV感染提出了新要求。HBV攜帶產(chǎn)婦準(zhǔn)備母乳喂養(yǎng)者，在進(jìn)行母乳喂養(yǎng)前需檢測(cè)乳汁中的HBV-DNA定量，這可能是預(yù)防和阻斷產(chǎn)后HBV母嬰傳播的有效措施之一。

[1]World Health Organization.Hepatitis B.World Health Organization Fact Sheet 204 dex.(Revised October 2000).WHO Web site[OL].http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/in html.

[2]Yao JL.Perinatal transmission of hepatitis B virus infection and vaccination in China[J].Gut,1996,38(1):S37-38.

[3]林堅(jiān),廖蒔,王春平.乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)與母嬰傳播的研究[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)雜志,2000,3(4):211-213.

[4]金春子,賈卉.132例乳汁中HBV-DNA PCR檢測(cè)結(jié)果分析[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,1997,5(5):20-22,26.

[5]羅世香,焦存仙.檢測(cè)孕婦血清、乳汁及新生兒血清乙肝標(biāo)志物的優(yōu)生學(xué)意義[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2000,8(2):74,115.

[6]Feinman SV,Berris B,Guha A,et al.DNA:DNA hybrization method for the diagnosis of HBV[J].J Viral Meth,1984,8(3):199-206.

[7]游泳,邢愛(ài)耘,鄭瑩,等.臍血與新生兒靜脈血檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物及 DNA的對(duì)比研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2005,36(2):290-291.

Study on HBV DNA in breast milk in pregnant women with HBV carrier

ZHU Yunxia1,ZHANG Hua1,ZOU Huaibin2,Liu Xin1,Li Zhuo1,CHEN Yu2,DUAN Zhongping2
(1.Department of Obstetrics and Gynecology,Beijing You′an Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069,China;2.Artificial Liver Center,Beijing You′an Hospital,Capital Medical University,Beijing 100069,China)

Objective:To study the relationship between the load of HBV-DNA in serum and breast milk and the serum HBV makers of pregnant women with HBV carrier,to explore the infectivity of breast milk in pregnant women with HBV carrier.Methods:A total of 207 pregnant women with HBV carrier and their neonates entered the study.Serum HBV-markers of the women were detected using electrical chemiluminescence immunoassay,the load of HBV-DNA in serum and breast milk of the women and in umbilical cord blood of the neonates were tested by real-time quantitative polymerase chain reaction.Results:The positive rate of HBV-DNA in breast milk was 9.6%and 2.4%in HBeAg-positive mothers group and HBeAg-negative mothers group,respectively(χ2=4.027，P=0.045),the positive rate of HBV-DNA in breast milk was 12.5%and in mothers with HBV-DNA≥106copies/ml and mothers with HBV-DNA<106copies/ml,respectively,the positive rate of HBV-DNA in umbilical cord blood was 15.17%and in neonates born to mothers with HBV-DNA≥106copies/ml and mothers with HBV-DNA<106copies/ml,respectively(P all<0.001).Conclusion:For the pregnant women with HBV carrier,mothers with HBeAg positive or HBV-DNA≥106copies/ml can increase the infectivity of breast milk.

Hepatitis B virus;Umbilical cord blood;Mother-to infant transmission;Breast milk

R512.6+1

A

1674-4721（2010）09（a）-007-03

張華（1955-），女，主任醫(yī)師；研究方向：乙型肝炎的母嬰阻斷。段鐘平，男，主任醫(yī)師；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院副院長(zhǎng)，北京市人工肝治療培訓(xùn)中心主任，衛(wèi)生部中國(guó)肝炎防治基金會(huì)治療及預(yù)防技術(shù)咨詢(xún)中心副主任；擔(dān)任中華肝病學(xué)會(huì)常委，中華肝病學(xué)會(huì)重肝與人工肝學(xué)組組長(zhǎng)，中華醫(yī)院管理學(xué)會(huì)血液凈化分會(huì)常委，擔(dān)任多家學(xué)術(shù)專(zhuān)業(yè)雜志的編委或常務(wù)編委，北京市和科技部肝病重大科技攻關(guān)項(xiàng)目首席專(zhuān)家，全國(guó)人工肝及血液凈化攻關(guān)協(xié)作組組長(zhǎng)；曾到多個(gè)國(guó)家進(jìn)行訪(fǎng)問(wèn)交流，發(fā)表學(xué)術(shù)論文40多篇，出版著作5本，獲得衛(wèi)生部等成果9項(xiàng)。

2010-07-20）