鹽酸多巴胺注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

葉青，王偉，迪麗努爾·沙比托夫(.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，烏魯木齊市830004；.新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊市8300)

鹽酸多巴胺注射液為腎上腺素受體及多巴胺受體激動(dòng)藥，臨床上主要用于抗休克。《中國(guó)藥典》2005年版二部中對(duì)鹽酸多巴胺注射液無(wú)熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項(xiàng)目[1]，但鹽酸多巴胺注射液作為臨床常用急救藥物，是以靜脈注射的方式進(jìn)入人體，臨床靜脈用藥中細(xì)菌內(nèi)毒素污染可引起發(fā)熱、寒戰(zhàn)、昏迷甚至死亡等副反應(yīng)，美、日、歐等藥典中對(duì)靜脈注射用注射液均規(guī)定有細(xì)菌內(nèi)毒素或熱原檢查項(xiàng)目。為了有效控制藥品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量，確保臨床用藥的安全，筆者按照《中國(guó)藥典》2005年版二部細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，對(duì)鹽酸多巴胺注射液進(jìn)行了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的研究。

1 材料

電熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械七廠)；微型旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；所使用容器和用具于250℃干烤1 h以上，備用。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):2007-4，效價(jià):每支150 EU)、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(BET水，批號(hào):w2006-12，規(guī)格:每支10 mL)均來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所；鱟試劑(TAL，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào):0612062；福州新北生化工業(yè)有限公司，批號(hào):06012012，靈敏度均為0.25 EU·mL－1，規(guī)格均為0.1 mL)；鹽酸多巴胺注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào):6E11003、6E11043、6E11059；江蘇亞邦強(qiáng)生藥業(yè)有限公司，批號(hào):060310、061024、060814，規(guī)格均為20 mg·2 mL－1)。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定[1]

根據(jù)公式:L＝K/M，其中K為按規(guī)定的給藥途徑，人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑為5 EU·kg－1·h－1；M為人用每千克體質(zhì)量每小時(shí)最大劑量。由于本品具有劑量依賴(lài)性，作用時(shí)間的長(zhǎng)短與用量不相關(guān)，且休克患者個(gè)體差異較大，靜滴速度和時(shí)間需根據(jù)血壓、心率、尿量等情況而定，故劑量選為20 mg，稀釋后靜滴[2]，中國(guó)人平均體質(zhì)量按60 kg計(jì)，計(jì)算限值為L(zhǎng)＝15 EU·mg－1，與《美國(guó)藥典》(USP32)中規(guī)定該藥品的L為16.67 EU·mg－1沒(méi)有明顯差異，故最終確定限值為15 EU·mg－1。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核

根據(jù)鱟試劑標(biāo)示靈敏度，用BET水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制備成2倍稀釋濃度的一系列內(nèi)毒素溶液:2λ、1λ、0.5λ、0.25λ。按照《中國(guó)藥典》2005年版二部[1]規(guī)定，進(jìn)行鱟試劑的靈敏度復(fù)核，結(jié)果2批鱟試劑經(jīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查，λc均在0.5λ～2λ范圍內(nèi)，均符合規(guī)定，可用于試驗(yàn)。

2.3 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的確定[1]

根據(jù)公式MVD＝cL/λ，其中c為供試品溶液的濃度10 mg·mL－1，L為鹽酸多巴胺注射液的內(nèi)毒素限值15 EU·mg－1，λ為鱟試劑標(biāo)示靈敏度，目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03 EU·mL－1之間，則對(duì)應(yīng)的最大有效稀釋倍數(shù)依次為300、600、1200、2500、5000倍。

2.4 干擾預(yù)試驗(yàn)[1，3]

為確定鹽酸多巴胺注射液對(duì)該方法的影響，首先進(jìn)行供試品干擾預(yù)試驗(yàn)。初步摸索可知鹽酸多巴胺注射液對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查有較強(qiáng)的抑制作用，由于鹽酸多巴胺注射液的pH值為3.0～4.5，故將樣品原液用無(wú)內(nèi)毒素污染的1 mol·L－1的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右(6.0～8.0范圍內(nèi))，用BET水分別稀釋至300、600、1200、2500、5000倍，將此系列濃度溶液記為供試品陰性對(duì)照管(NPC)。同時(shí)制備含有2λ濃度細(xì)菌內(nèi)毒素的上述濃度溶液，記此系列溶液為供試品陽(yáng)性對(duì)照管(PPC)。取靈敏度為0.25 EU·mL－1的2個(gè)不同廠家的鱟試劑，分別與上述NPC和PPC進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度平行做2管，并設(shè)陽(yáng)性(PC)與陰性(NC)對(duì)照。結(jié)果見(jiàn)表1(“+”為陽(yáng)性反應(yīng)結(jié)果，“-”為陰性反應(yīng)結(jié)果)。

表1 干擾預(yù)試驗(yàn)結(jié)果Tab 1Results of preliminary interference test

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)鹽酸多巴胺注射液稀釋至600倍時(shí)，對(duì)2個(gè)鱟試劑廠家的試劑的反應(yīng)均無(wú)干擾作用，故選擇600倍作為正式干擾試驗(yàn)稀釋倍數(shù)。

2.5 干擾試驗(yàn)

為了最終確認(rèn)是否存在干擾因素的影響，進(jìn)行以下干擾試驗(yàn)。取6批鹽酸多巴胺注射液分別調(diào)節(jié)pH至7.0后，用BET水分別稀釋至600倍，按《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄中的“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試品干擾試驗(yàn)”項(xiàng)進(jìn)行試驗(yàn)[1]，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 干擾試驗(yàn)結(jié)果Tab 2Results of interference test

表2結(jié)果表明，細(xì)菌內(nèi)毒素在2個(gè)系列中反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值(Es、Et)在0.5λ～2λ之間，且Et/Es均在0.5～2.0范圍之內(nèi)，確認(rèn)供試品溶液在調(diào)節(jié)pH值后，稀釋至600倍(濃度為0.0167 mg·mL－1)對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)沒(méi)有干擾作用，可進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.6 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

按《中國(guó)藥典》細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，使用2批靈敏度為0.25 EU·mL－1的不同廠家的鱟試劑，分別對(duì)6批供試品在pH值調(diào)至7.0、濃度稀釋至0.0167 mg·mL－1后進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并同時(shí)設(shè)立樣品的自身陽(yáng)性對(duì)照管，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 6批樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果Tab 3Results of endotoxin detection of sample

表3結(jié)果表明，6批鹽酸多巴胺注射液可使用靈敏度為0.25 EU·mL－1的鱟試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，且內(nèi)毒素含量小于15 EU·mg－1。

3 討論

由于不同廠家生產(chǎn)的鱟試劑的抗干擾能力存在差別，為保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，本試驗(yàn)選擇2個(gè)廠家生產(chǎn)的鱟試劑對(duì)樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品對(duì)鱟試劑凝集反應(yīng)的干擾性質(zhì)為抑制作用，僅通過(guò)稀釋的方法不能排除干擾；因鹽酸多巴胺注射液的pH值范圍在3.0～4.5之間，超出了鱟試劑本身具有的緩沖能力，按照《中國(guó)藥典》2005年版[1]的規(guī)定，供試品溶液的pH值一般要求在6.0～8.0的范圍內(nèi)，故將樣品pH值調(diào)至7.0左右，濃度稀釋至0.0167 mg·mL－1后，再使用2個(gè)廠家的鱟試劑對(duì)2個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的6批樣品進(jìn)行干擾試驗(yàn)，結(jié)果Et/Es均在0.5～2.0范圍之內(nèi)，確定樣品在有效濃度范圍內(nèi)。樣品對(duì)鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)雖有抑制性干擾作用，但可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH值和稀釋的辦法排除。結(jié)果表明，將限值定為15 EU·mg－1時(shí)，鹽酸多巴胺注射液用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法控制產(chǎn)品質(zhì)量是可行的。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄85～88.

[2]統(tǒng)一藥品說(shuō)明書(shū)及批準(zhǔn)文號(hào)專(zhuān)項(xiàng)工作小組編.國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥說(shuō)明書(shū)內(nèi)容匯編[M].2002:5～101.

[3]劉春，趙毓梅.馬來(lái)酸氯苯那敏注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查[J].中國(guó)藥房，2009，20(25):1990.