乳糖酶固態發酵法制備影響因素分析

康福忠，張 勇，王立紅，董惠鋒，劉鼎闊*

（1.天津市獸藥飼料監察所，天津 300402；2.鼎正動物藥業（天津）有限公司，天津 300402）

乳糖酶在食品、醫藥、養殖飼料等方面具有廣泛的應用價值，但由于受乳糖酶發酵工藝的復雜性限制，致使其并未能夠得到大規模的生產和使用。本試驗利用亮毛霉固態發酵法產生乳糖酶，分析不同條件對其產酶效果的影響，確定了固態發酵法產酶的最佳工藝路線，以期為乳糖酶的生產奠定理論基礎。

1 試驗材料

1.1 儀器設備

J-25型高速冷凍離心機、DL201型恒溫自動干燥箱、BS-2F恒溫振蕩培養箱、HZQ-F160全溫振蕩培養箱、磁力攪拌器、JA2003電子天平、DZKW-C型水浴鍋、蒸氣消毒器、Delta 320 pH計。

1.2 試驗材料

亮毛霉（購自中國獸醫藥品監察所）、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖等。

2 試驗方法

2.1 固體培養基制備

將麩皮和蒸餾水、黃豆粉和蒸餾水、玉米粉和蒸餾水分別按1：1混合放入250 mL三角瓶中，其中固體物質定量為10 g，攪拌均勻，分別作為基礎培養基1、2、3。進行高壓滅菌，冷卻后制備菌懸液，將已接種的三角瓶放入30℃的恒溫培養箱中進行3～5 d培養。

2.2 粗酶液的制備

用8倍體積的水浸提發酵過的麩皮，并勻速攪拌30 min。經4層紗布過濾后即得粗酶液，靜置取上清液保存備用。

2.3 乳糖酶提取

硫酸銨分級沉淀法：將硫酸銨烘干研細，取200 mL上清液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至其濃度達20%， 4℃ 靜置2 h，4℃，7 000 rpm離心 15 min），沉淀溶于 0.005 mol·L-1、pH 6.28 的磷酸鹽緩沖液，測定酶活力。上清液繼續加入硫酸銨粉末至濃度達40%，靜置離心，沉淀溶于緩沖液，測定酶活力。

2.4 固體培養的單因素試驗

2.4.1 確定最佳碳源

在基礎培養基中以0.04 g·mL－1的比例加入葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉，制備菌懸液接種培養，觀察培養情況，并測定酶活力以確定最佳的外加碳源。

2.4.2 確定最佳氮源

在基礎培養基中以0.02 g·mL－1的比例加入蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、氯化銨、硝酸銨，制備菌懸液接種培養，觀察培養情況，并測定酶活力以確定最佳的外加氮源。

2.4.3 無機鹽

在選中的基礎培養基中分別按0.1%的比例加入ZnCl2、Al2（SO4）3、CaCl2、FeCl2、CuSO4、MnSO4、KH2PO4，制備菌懸液接種培養，觀察培養情況，并測定酶活力。

2.4.4 固液比

培養基的固液比分別為 1： 0.5、1：1、1： 1.5、1：2、1：2.5，在其中接入21 mL孢子懸液，觀察培養情況，并測定酶活力以確定最佳的固液比。

2.4.5 改變接種量

在基礎培養基中，分別接菌懸液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，制備菌懸液接種培養。觀察培養情況。并測定酶活力以確定最佳的接種量。

3 結果與分析

3.1 基礎培養基的選擇

不同基礎培養基對乳糖酶產量的影響見圖1。

圖1 不同基礎培養基對乳糖酶產量的影響

由圖1可知，用麩皮和水的基礎培養基培養實驗室霉菌產生的乳糖酶活力最高，并且麩皮價格低廉，來源穩定，在未來擴大化培養和乳糖酶工業化生產中也適合作為基礎培養基。大豆粉和玉米粉在加入水發酵培養后容易形成黏稠固形物，不適合后期乳糖酶的分離提取。故麩皮最適合亮毛霉進行固體培養。麩皮之間的空隙較大，有利于氧氣的流通，適合進行固態培養。

3.2 外加碳源對乳糖酶產量的影響

外加碳源對乳糖酶產量的影響見圖2。

碳源是菌體細胞組成的原料，也是菌體生長發育必需的能源物質。某些碳源是酶的誘導物，選擇適宜的碳源有利于定向促進某些酶的合成，提高相應酶的產量[1]。

由圖2可知，麥芽糖、蔗糖對乳糖酶的生成都無明顯作用，可溶性淀粉和葡萄糖對乳糖酶的生成有一定抑制作用，而乳糖的加入則略微促進了乳糖酶的生成。符合乳糖操縱子學說，因此選擇乳糖作為乳糖酶固態發酵生產的外加碳源。

3.3 外加氮源對乳糖酶產量的影響

外加氮源對乳糖酶產量的影響見圖3。

圖2 外加碳源對乳糖酶產量的影響

圖3 外加氮源對乳糖酶產量的影響

氮是組成細胞蛋白質和核酸的主要元素之一。通常分為無機氮源和有機氮源，不同的氮源對產酶能力有不同的影響，一般來說，有機氮源對菌體的生長產酶較為有利，而菌體對無機氮源的利用則較差[2]。由圖3可知，外加氮源中，3種有機氮源的加入都對乳糖酶的產生起到促進作用，其中蛋白胨的效果最明顯。而無機氮源，在一定程度上抑制了乳糖酶的產生。故外加氮源選擇蛋白胨比較合適。

3.4 不同無機鹽的添加對乳糖酶產量的影響

無機鹽對乳糖酶合成的影響見圖4。

除了碳源和氮源外，一些常量元素和微量元素也影響菌體的生長和酶的形成[3]。

圖4 無機鹽對乳糖酶合成的影響

由圖4可見，培養基中添加KH2PO40.1%時最有利于乳糖酶的產生。ZnCl2和CuSO4的加入抑制了乳糖酶的產生。因此選取KH2PO4添加入固態發酵培養基以增加乳糖酶的產量。

3.5 固液比對乳糖酶產量的影響

培養基固液比對乳糖酶產量的影響見圖5。

圖5 培養基固液比對乳糖酶產量的影響

固液比不同，相應的乳糖酶的產量也不同。當加水量過低時，水分缺乏，不足以提供微生物生長所必需，故菌體生長緩慢，相應的產酶量較低；當加水量過高時，水分過多，不利于空氣的流通，影響酶的產量。由圖5可知，隨著固液比的增高，乳糖酶活力先增后減。其中當固液比為 1：1.5時，乳糖酶產量最高。

3.6 接種量對酶產量的影響

接種量對乳糖酶產量的影響見圖6。

圖6 接種量對乳糖酶產量的影響

由圖6可知，在一定范圍內酶的產量隨著接種量的增加而增加，這個范圍的臨界點為10%～15%。故接種量在這個臨界點附近時，酶的產量相對較高。

4 小結

乳糖酶在食品、醫藥、飼料等領域中的應用具有廣闊的前景，已經成為生物領域新的熱點之一，但由于乳糖酶的生產、純化等過程比較困難，所以一直以來乳糖酶未能得到廣泛應用。固態發酵工藝是一門很古老的技術，已在眾多的領域得到應用，利用固態發酵進行各種酶類的生產已經成為常用的技術手段。所需的設備簡單，便于生產，各領域上都得到了很大發展。隨著人們對固態發酵機理認識不斷加深，固態發酵中存在的一些問題也有望逐步得到解決和完善，使利用固態發酵技術進行酶的大規模生產完全成為可能。尤其在能源危機和環境問題日益突出的今天，固態發酵作為一種綠色生產工藝，將會有更加廣闊的應用前景。現代固態發酵技術的進步也將促進工業發酵水平的不斷完善與提高，使工業化生產向著綠色、環保、安全的方向發展。

[1]姚躍飛,曾柏全.現代固態發酵技術在食品加工業中的應用[J].食品與機械,2005（6）:89-92.

[2]俞俊裳.新編生物工藝學[M].北京:化學工業出版社,2003.

[3]李興峰.乳糖酶高產菌株分離篩選、發酵產酶及酶學性質的研究[D].保定:河北農業大學,2004.