阿托伐他汀對低氧大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖凋亡的影響

蔣凌志，張慶光，鐘 華

(廣州醫學院荔灣醫院ICU，廣東 廣州 510170)

阿托伐他汀是當前最強效的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，廣泛用于降脂，能誘導兔髂動脈平滑肌細胞凋亡[1]。本課題前期研究發現阿托伐他汀可以減輕低氧大鼠肺動脈高壓、改善肺血管重塑[2]。由于肺動脈管壁主要由平滑肌構成，本研究利用常壓低氧艙復制低氧肺動脈高壓大鼠模型，觀察阿托伐他汀對大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 低氧大鼠模型復制及實驗分組 無特定病原體(SPF)級雄性SD大鼠40只，體重(180±20)g(廣東省動物實驗中心提供，合格證號2007A003)。隨機分為4組：對照組(Control，C)、低氧組(Hypoxia，H)、干預組Ⅰ、干預組Ⅱ，每組10只。干預組Ⅰ、Ⅱ組每天低氧前30 min分別灌胃給予阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司進口分裝，批號85837007)1.5 mg/kg和3.0 mg/kg，對照組(C)和低氧組(H)給予生理鹽水0.5 ml。除對照組外，其他組置于常壓低氧箱內，箱內氧濃度穩定于（10±0.5）%，每天低氧8 h，每周6 d，連續4周。

1.2 肺組織標本的取材和制備 實驗結束時打開大鼠胸腔，取一側肺葉以10%甲醛緩沖液固定，梯度酒精順序脫水，二甲苯透明后石蠟包埋切片(厚5μm)，用于免疫組織化學分析和原位缺口末端標記法(TUNEL)研究。

1.3 增殖細胞核抗原(PCNA)的免疫組織化學檢測 所有組織標本均在同一條件下進行免疫組織化學染色，一抗為小鼠抗大鼠PCNA抗體(武漢博士德，批號20080801)，二抗為羊抗小鼠免疫組化試劑盒(武漢博士德，批號200811)。PCNA陽性染色呈棕黃色細顆粒狀，主要位于細胞核。每只大鼠取一張切片，高倍鏡下觀察10條血管外徑約為100μm的肺小動脈，計數平滑肌細胞總數及PCNA陽性細胞數目，計算PCNA陽性細胞所占百分比，即增殖指數(PI)。

1.4 TUNEL應用末端轉移酶介導的dUTP切口末端標記法(TUNEL)檢測凋亡細胞 操作按細胞凋亡檢測試劑盒(Roche Diagnotics GmbH，14492200)說明書進行，細胞核中有棕褐色顆粒者為陽性，即凋亡細胞。每只大鼠測量10條血管外徑約為100μm的肺小動脈，計算平滑肌細胞凋亡數目與細胞總數比值，即凋亡指數(AI)。

1.5 統計學處理 用SPSS11.0軟件進行統計學分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差(±s)表示，多組間總體差異比較采用單因素方差分析，兩組間差異比較采用q檢驗，檢驗水準為а=0.05。

2 結果

2.1 阿托伐他汀對大鼠肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)增殖的影響 各組均可見增殖的PASMC細胞。低氧組PASMCs的PI較對照組顯著增高（P＜0.01）；干預組Ⅰ、ⅡPASMCs的PI與低氧組比較明顯下降，差異均具有統計學意義（P＜0.01），提示阿托伐他汀對低氧大鼠PASMCs增殖有抑制作用，但兩干預組之間比較，差異無統計學意義，見表1。

2.2 阿托伐他汀對大鼠PASMCs凋亡的影響 各組均可見凋亡的PASMCs細胞。低氧組大鼠PASMCs的AI與對照組比較顯著下降（P＜0.05）。干預組Ⅰ、Ⅱ大鼠PASMCs的AI與低氧組比較顯著增高（P＜0.05），提示阿托伐他汀對低氧大鼠PASMCs凋亡有促進作用，但兩組之間比較，差異無統計學意義，見表1。

表1 阿托伐他汀對低氧大鼠肺動脈平滑肌增殖與凋亡的影響（±s）

表1 阿托伐他汀對低氧大鼠肺動脈平滑肌增殖與凋亡的影響（±s）

注：與對照組比較,*P＜0.01；與低氧組比較,△P＜0.05。

組別 例數 增殖指數PI(%)凋亡指數AI(%)對照組低氧組干預組Ⅰ干預組Ⅱ101010104.5±0.528.0±2.4*17.0±2.9△14.0±1.3△4.1±0.43.0±0.3*9.20±2.71△11.5±3.79△

3 討論

近年發現他汀類藥物對低氧肺動脈高壓有治療作用[3-5]，本課題前期研究也證實阿托伐他汀可以減輕低氧大鼠肺動脈高壓、改善肺血管重塑[2]。肺血管重塑的機制是細胞增殖與凋亡的平衡破壞，慢性缺氧時肺動脈壁細胞增殖加強而凋亡減少[6]。

實驗結果顯示各組大鼠肺組織切片中PASMCs細胞增殖和凋亡狀態并存。對照組增殖與凋亡基本平衡；低氧組大鼠PASMCs增殖顯著增加、凋亡顯著下降，因而出現顯著的肺血管重塑；與低氧組比較，兩干預組大鼠PASMCs增殖顯著降低、凋亡增加，但增殖仍超過凋亡，故肺血管仍有重塑現象，程度有所減輕。干預組PASMCs的AI與對照組比較有增加的趨勢，與文獻報道[7-8]一致。說明阿托伐他汀對低氧大鼠PASMCs存在雙重影響：既可以抑制其增殖，又可以促進其凋亡，并通過這兩方面作用達到抑制肺血管重塑的效果。而兩干預組(1.5 mg/kg或3.0 mg/kg阿托伐他汀灌胃)之間比較，不論是PI還是AI均無明顯差異，提示阿托伐他汀抑制PASMCs增殖，促進PASMCs凋亡的作用可能不存在劑量依賴。

有研究證實阿托伐他汀影響細胞增殖及凋亡與信號傳導與轉錄激活因子（Stat3）通路密切相關，Stat3磷酸化活性調節其下游靶基因的表達[9]，因此，阿托伐他汀對Stat3下游靶基因Cyclin D1、Bcl-2的影響將在我們今后的實驗中進一步深入研究。

[1]陳 斌,鄧玉蓮,吳志勇,等.阿托伐他汀對兔動脈粥樣硬化模型血管壁平滑肌細胞凋亡的影響[J].中國老年學雜志,2004,24(6):542-544.

[2]蔣凌志,張慶光,鐘 華.阿托伐他汀預防低氧性肺動脈高壓的實驗研究[J].實用醫學雜志,2009,25(24):4014-4136.

[3]Girgis RE,Li D,Zhan X,et al.Attenuation of chronic hypoxic pulmonary hypertension by simvastatin[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285:938-945

[4]潘殿柱,李永春.阿托伐他汀對低氧大鼠肺血管重建的影響[J].中國全科醫學,2005,14:1149-1151.

[5]張郁青,張秀偉,朱 穎,等.阿托伐他汀對慢性阻塞性肺疾病合并肺動脈高壓患者的影響[J].心肺血管病雜志,2009,28(4):250-253.

[6]陶清國,張珍祥,徐永健.慢性缺氧大鼠肺內(肺血管壁)細胞增殖、凋亡及c-myc、P53基因表達研究[J].中國應用生理學雜志,1999,15(2):169-172.

[7]Fouty BW,Rodman DM.Mevastatin can causes G1 arrest and induse apoptosis in pulmonary artery smooth muscle cells through a p27kip-independent pathway[J].Circ Res,2003,92(5):501-509.

[8]Nishimura T,VaszatL T,Faul JL.Simvastatin rescues rats from fatal pulmonary hypertension by inducing apoptosis ofneointimal smoothmusclecells[J].Circulation,2003,108(13):1640-1645.

[9]唐 梅,張 鉦,寧金民,等.JAKZ/STAT3信號通路在阿托伐他汀抗大鼠血管平滑肌細胞增殖凋亡中的作用研究[J].中國分子心臟病學,2006,6(3):161-165.