B細胞趨化因子對CVB3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影響①

高志云 揣 俠 藍佳明 劉貴霞 李 劍 張永紅 王永祥

(河北醫科大學病原生物學教研室,石家莊050017)

B細胞趨化因子對CVB3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影響①

高志云 揣 俠 藍佳明 劉貴霞 李 劍 張永紅 王永祥

(河北醫科大學病原生物學教研室,石家莊050017)

目的:探討B細胞趨化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)對柯薩奇病毒B3融合基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1免疫效果的影響。方法:將BALB/c小鼠隨機分為4組,分別肌肉注射pcDNA3、pcDNA3/BLC、pcDNA3/C3d3-sVP1和含pcDNA3/BLC與pcDNA3/C3d3-sVP1的混合質粒,于免疫后不同時間檢測小鼠血清的中和抗體滴度、特異性CT L殺傷活性;以LD50的CVB3病毒液感染已免疫小鼠,檢測小鼠血中病毒滴度,觀察存活情況以評價各種疫苗的免疫保護作用。結果:小鼠的中和抗體滴度隨免疫次數增加而提高,混合組中和抗體滴度(42.17±1.43)和特異性CT L殺傷率(41.3%±3.51%)均明顯高于pcDNA3/C3d3-sVP1組(P<0.05),而血中病毒滴度低于pcDNA3/C3d3-sVP1組;經致死量CVB3感染后,pcDNA3/BLC和pcDNA3/ C3d3-sVP1混合免疫的小鼠生存率達44%,生存率高于其他各組。結論:BLC可顯著提高C3d3-sVP1基因誘導的特異性免疫應答,增強基因疫苗對機體的免疫保護作用。

B細胞趨化因子;補體3d;柯薩奇病毒B3;基因疫苗

柯薩奇病毒B組(Coxsackievirus group B,CVB)是人類病毒性心肌炎的主要病原體,以CVB3最為重要,迄今尚無有效的預防措施。本室前期將編碼分泌型CVB3 VP1的基因和三拷貝C3d分子的基因拼接,構建了靶向B細胞的基因疫苗pcDNA3/ C3d3-sVP1,免疫小鼠后能誘導較高水平的中和抗體,對致死量CVB3感染有一定保護力,但其免疫保護作用仍不理想[1]。推測與本疫苗缺乏對B細胞的有效趨化,導致成熟B細胞在肌肉組織中分布甚少有關。

[Abstract]淋巴細胞趨化因子(B-lymphocyte chemoattractant,BLC)是人B淋巴細胞的特異性趨化因子,并對部分T細胞也有趨化作用[2]。本研究將BLC真核表達質粒作為基因佐劑,比較pcDNA3/C3d3-sVP1單獨免疫和BLC質粒協同免疫誘導產生的免疫應答,為研制新型CVB3基因疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒與毒株 真核表達質粒pcDNA3/BLC由Nancy HR博士和John RP教授惠贈;真核表達質粒pcDNA3/C3d3-sVP1為河北醫科大學病原生物學教研室前期實驗中構建[1]。采用堿裂解法大量制備質粒DNA,并用PEG法對之進行純化[3]。CVB3 Nancy株由本室保存。

1.2 免疫接種 純系BALB/c小鼠購自河北醫科大學實驗動物中心,4～6周齡,雄性,隨機分為4組,分別為pcDNA3組、pcDNA3/BLC組、pcDNA3/C3d3-sVP1組、pcDNA3/B組21只,各組高滲蔗糖溶液合組pcDNA3/外,其余各組間隔4周免疫14天眼眶靜的中和抗體滴

LC與pcDNA3/C3d3-sVP1混合組,每于小鼠右側大腿股四頭肌處注射25% 100μl,30分鐘后原位注射質粒,除混BLC與pcDNA3/C3d3-sVP1各50μg/只劑量為100μg/只,注射前將質粒混勻, 1次,共免疫3次。每次于接種后第脈取血,采用微量中和試驗法檢測血清度。

1.3 特異性CT L檢測 第三次免疫后2周,每組取3只小鼠處死,無菌取脾。將脾淋巴細胞用 IL-2、ConA和滅活的CVB3體外刺激3天,作為效應細胞。用經滅活的CVB3體外刺激1天的SP2/0細胞作為靶細胞。以效靶比為40∶1進行實驗,靶細胞以含10%新生牛血清的1640培養液稀釋至1×105ml-1,加入96孔板中,每孔100μl,每孔加入效應細胞100 μl,同時加入 IL-2、ConA和滅活的CVB3刺激,于37℃,5%CO2孵箱中培養24小時,采用CCK-8(cell counting kit-8,購自日本同仁化學研究所)法檢測脾細胞殺傷活性,具體操作按說明書進行。同時設效應細胞孔和靶細胞孔各3復孔。殺傷率(%)=[1-(效靶A值-效應細胞A值)/靶細胞A值]×100%。

1.4 病毒的增殖和效價滴定 按常規在Hela細胞上培養CVB3,將病毒10倍遞次(10-1～10-10)稀釋; 18～20周齡BALB/c小鼠56只,按每組8只分成7組,分別注射10-4～10-107個稀釋度的病毒,每只0.2 ml;逐日觀察記錄動物死亡數,根據 Reed-Muench法,計算LD50。

1.5 免疫小鼠的病毒感染 在小鼠3次免疫后第3周,每組取3只小鼠,腹腔注射含3 LD50的CVB3病毒液各0.2 ml。于注射后第7天,檢測血中病毒滴度。同時,每組剩余的15只小鼠腹腔注射含4 LD50的CVB3各0.2 ml,觀察小鼠存活情況至注射后第14天,用SPSS統計軟件進行生存分析。

1.6 統計學處理 本實驗數據采用SPSS11.0軟件處理,以±s表示,中和抗體、病毒滴度和CT L殺傷率采用單因素方差分析和LSD-t檢驗;小鼠生存率和生存時間分別采用行×列表資料的Fisher確切概率法和Kaplan-Meier生存分析法。

2 結果

2.1 血清中和抗體水平 各組各次免疫后血清中和抗體平均滴度見表1。從表中可以看出,pcDNA3/ C3d3-sVP1組、pcDNA3/BLC與 pcDNA3/C3d3-sVP1混合組抗體滴度隨免疫次數的增加而提高,經單因素方差分析表明,差別有統計學意義(P<0.01)。第3次免疫后,混合組的抗體效價最高,經 t檢驗,除pcDNA3組與pcDNA3/BLC組相比差別無統計學意義(P>0.05)外,其余各組兩兩比較均有統計學意義(P<0.01)。混合組血清中和抗體平均滴度高于pcDNA3/C3d3-sVP1組。

2.2 CVB3特異性CT L活性 效靶比為40∶1時,混合組的殺傷率為(41.3%±3.51%)高于pcDNA3組17.0%±2.00%)、pcDNA3/BLC組(20.0%±1.29%)和pcDNA3/C3d3-sVP1組(36.3%±2.52%)。混合組殺傷率高于其它各組,差異均有統計學意義(P< 0.01),見圖1。

2.3 血中病毒CVB3滴度測定 pcDNA3/BLC+ pcDNA3/C3d3-sVP1混合組小鼠血中病毒滴度為(2.16±0.12)低于pcDNA3組 (4.83±0.21)、pcDNA3/BLC組 (4.43±0.23)和pcDNA3/C3d3-sVP1組(2.50±0.31)。混合組和其它各組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。

表1 中和抗體平均滴度(±s)Tab.1 Mean neutralizing antibody titers(±s)

表1 中和抗體平均滴度(±s)Tab.1 Mean neutralizing antibody titers(±s)

Note:After the third immunization:1)Compared with pcDNA3/C3d3-sVP1 (P<0.01).

Groups After the first immunization After the second immunization After the third immunization pcDNA3 <1∶5 <1∶5 <1∶5 pcDNA3/BLC <1∶5 <1∶5 <1∶5 pcDNA3/C3d3-sVP1 7.94±1.41 19.95±1.52 31.62±1.41 pcDNA3/BLC+ pcDNA3/C3d3-sVP1 8.41±1.37 23.71±1.54 42.17±1.431)

2.4 小鼠注射CVB3后的生存情況 小鼠在接種CVB3第3天起開始發病,表現為行動遲緩、精神萎靡、毛發打綹,進食量下降,第4天開始死亡。各組在21天后的生存率分別為:混合組44%,pcDNA3/ sVP1-C3d3組33%,pcDNA3組和pcDNA3/BLC組無生存。用 Kaplan-Meier法進行生存分析,生存率曲線如圖2所示,pcDNA3/BLC+pcDNA3/C3d3-sVP1混合組生存率高于pcDNA3組和pcDNA3/BLC組(P<0.05),但與pcDNA3/C3d3-sVP1組的差異無統計學意義。

圖1 不同組小鼠的CTL應答Fig.1 The CTL response of BALB/c mice in different groups

圖2 4 LD50攻擊后小鼠生存曲線Fig.2 Survival curve of BALB/c mice challenged with 4 LD50CVB3

3 討論

有研究顯示,三拷貝C3d分子與抗原偶聯后可增強抗原的免疫原性。這主要是由于C3d與B細胞上的受體CR2結合可為抗原與B細胞受體的交聯提供共刺激信號,降低B細胞的活化閾值,促進抗體的親和力成熟,調節B細胞與T細胞之間的相互作用,從而提高了疫苗的免疫原性。我們前期實驗將編碼分泌型CVB3 VP1的基因和三拷貝C3d分子的基因拼接,構建了靶向B細胞的基因疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1,免疫小鼠后獲得了較高水平的中和抗體和特異性CT L殺傷活性,但免疫保護作用仍未能達到滿意的效果,推測其原因之一可能是C3d3雖然能將分泌到細胞外的VP1抗原靶向提呈,被具有C3d受體的抗原提呈細胞-B細胞捕獲,但由于成熟B細胞在肌肉組織中分布較少,即缺乏對B細胞的有效趨化而導致免疫效果不理想。

[Abstract]LC是唯一有選擇性吸引B淋巴細胞作用的趨化因子,屬于CXC類亞家族,首先在1998年發現,主要來源于脾、胸腺、淋巴結、闌尾等器官,其受體CXCR5分布在所有的外周成熟B細胞和少量的T細胞亞型上,通過BLC與受體結合可特異性趨化B細胞,并能促進其分化成熟[2,4]。有研究顯示[5],經BLC修飾的弱免疫原性的抗原其免疫原性明顯增強,故通過局部過表達BLC,促進B細胞的游走和激活,而后C3d偶聯抗原可以與表達在B細胞和濾泡樹突狀細胞的CR2非特異性結合,被CR2+細胞內吞,促進了通過MHCⅡ類途徑的抗原提呈。而且,BLC能夠趨化特異抗原記憶性B細胞進入次級淋巴器官,迅速產生抗體[6]。本研究表明,混合組小鼠中和抗體滴度明顯高于其他組;用致死量病毒感染后,血中病毒滴度顯著降低,保護率高于其他各組;還可提高特異性細胞免疫水平。

綜上所述,BLC與核酸疫苗pcDNA3/C3d3-sVP1的聯合免疫可顯著提高疫苗的免疫效果,提示BLC作為一種新型的基因佐劑在抗CVB3感染免疫中具有良好的應用前景,為進一步研制高效的CVB3 DNA疫苗提供了基礎。

1 趙 娜,韓小艷,王曉凌 et al.C3d對分泌型柯薩奇病毒B組3型VP1DNA疫苗的免疫增強作用[J].中華醫學雜志,2007;87(36): 2561-2563.

2 Gunn M D,Ngo V N,Ansel KMet al.A B-cell-homing chemokine made in lymphoidfollicles activates Burkitt’s lymphoma receptor-1[J].Nature, 1998;391(6669):799-803.

3 薩母布魯克J,拉塞爾D W著.黃培堂 et al譯.分子克隆實驗指南[M].第3版.北京:科學出版社,1998:26-96.

4 Sehaerli P,Willimann K,Alois Bet al.CXC chemokine receptor 5 expression defines follicular homing T cells with B cell Helper function[J]. J Exp Med,2000;192(11):1553-1562.

5 Guo J H,Fan M W,SunJ Het al.Fusionof antigen to chemokine CCL20 or CXCL13 strategy to enhance DNA vaccine potency[J].Int Immunopharmacol,2009;9(7-8):925-930.

6 Blink EJ,Light A,Kallies Aet al.Early appearance of germinal centerderived memory B cells and plasma cells in blood after primary immunization[J].J Exp Med,2005;201(4):545-554.

[收稿2009-06-03 修回2009-09-29]

(編輯 倪 鵬)

The influence of B-lymphocyte chemoattractant on the immune response of CVB3 fusion gene vaccine pcDNA3/C3d3-sVP1

G AO Zhi-Yun,CHUAI Xia,LAN Jia-Ming,LIU Gui-Xia,LI Jian,ZHANG Yong-Hong,WANG Yong-Xiang.Department of Pathogenic Biology,Hebei Medical University,Shijiazhuang050017,China

Objective:T o investigate the influence of B-lymphocyte chemoattractant on the immune response of CVB3 fusion gene vaccine pcDNA3/C3d3-sVP1.Methods:BALB/c mice were divided into 4 groups randomly,and injected intramuscularlywith pcDNA3,pcDNA3/ BLC,pcDNA3/C3d3-sVP1 and the combination with the plasmid pcDNA3/BLC and pcDNA3/C3d3-sVP1.At a certain time,they were measured for the titersfor neutralizing antibodies,specific CT L cytotoxic activity.The protective efficacyof DNA vaccinations was evaluated by titers of blood viruses and survival rate.Results:The titers for antibodies increased with the time of inoculation.More specifically,the antibody titers (42.17±1.43)and the specific CT L cytotoxic activity(41.3%±3.51%)of the mice in the combination group were remarkably stronger than in the mice with pcDNA3/C3d3-sVP1(P<0.05),but the virus titers of blood was lower.After lethal CVB3 challenge,the protection of mice from death in the combination group with the plasmid pcDNA3/BLC and pcDNA3/C3d3-sVP1 was 44%.Survival curves indicated that the survive state of combination group was better than others.Conclusion:BLC can strongly enhance the specific immunity induced by C3d3-sVP1.

B-lymphocyte chemoattractant;Complement 3d;Coxsackieviruses B3;Gene vaccine

R373.2 文獻標識碼 A 文章編號 1000-484X(2010)02-0117-03

①本文為河北省科學技術研究與發展計劃項目(No.08276101D-93)

高志云(1978年-),女,碩士,講師,主要從事病毒學研究,E-mail:gxfc-9879@163.com;

及指導教師:王永祥(1949年-),男,教授,碩士生導師,主要從事病毒學研究,E-mail:wangyongxiang1@ yahoo.com.cn。