消減免疫法制備抗H L60、H L60/ADR表面抗原差異抗體①

任思楣 俞 云佘 鳴 邵曉楓 師銳贊 彭洪薇 林 陽(yáng) 張秀麗 張硯君 熊冬生

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300020)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

消減免疫法制備抗H L60、H L60/ADR表面抗原差異抗體①

任思楣 俞 云②佘 鳴 邵曉楓 師銳贊 彭洪薇 林 陽(yáng) 張秀麗 張硯君 熊冬生

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300020)

目的:建立可特異識(shí)別HL60和HL60/ADR細(xì)胞膜表面差異蛋白的抗體庫(kù),制備單克隆抗體并研究其生物學(xué)活性。方法:通過Cp誘導(dǎo)的消減免疫法免疫BALB/c小鼠,采用傳統(tǒng)雜交瘤技術(shù)制備可特異識(shí)別兩種細(xì)胞差異膜蛋白的單克隆抗體;采用FACS和激光共聚焦顯微鏡鑒定其和兩種靶細(xì)胞結(jié)合的特異性和差異性。結(jié)果:獲得51株候選的差異抗體,成功篩選并純化其中一株單抗(5F6)。5F6與可特異穩(wěn)定的識(shí)別HL60/ADR細(xì)胞,結(jié)合率扣除本底為68.2%,而該抗體與HL60細(xì)胞的結(jié)合率為17%。結(jié)論:SI結(jié)合差異篩選的方法是制備差異抗體便捷可行的方法,所獲得的單克隆抗體與HL60和HL60/ADR細(xì)胞膜蛋白結(jié)合有特異性和差異性,實(shí)驗(yàn)中所獲得的單抗是尋找腫瘤耐藥的新靶點(diǎn)和發(fā)現(xiàn)腫瘤耐藥新機(jī)制的工具,為研究這些問題開拓了新思路。

消減免疫;腫瘤耐藥;單克隆抗體;差異識(shí)別

腫瘤耐藥是腫瘤治療中的難題,也是目前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制主要有:P-糖蛋白,多藥耐藥相關(guān)蛋白,包括拓?fù)洚悩?gòu)酶、二氫葉酸還原酶、醛脫氫酶等酶類以及和凋亡相關(guān)的一些蛋白等等,其中能在臨床上得到證實(shí)甚至應(yīng)用的卻很少,因而發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制和耐藥新靶點(diǎn)迫在眉睫。本實(shí)驗(yàn)采用消減免疫方法,獲得了數(shù)株可特異識(shí)別敏感腫瘤和耐藥腫瘤表面差異蛋白的單克隆抗體,為腫瘤多藥耐藥新靶點(diǎn)和新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞系 小鼠SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、H L60細(xì)胞系,耐阿霉素人急性白血病細(xì)胞系(H L60/ADR),耐藥倍數(shù)為130倍,均由本室保存; BALB/c小鼠(4～6周齡),購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI1640(Hy CLIONEPIERCE)、HAT、HT、PEG 1450(Invitrogen);Cyclophosphamide (Cp)、Pristane、DAPI(Sigma);蛋白 G親和色譜柱(Pharmacia);羊抗鼠 IgG-FITC、胎牛血清(本所科技開發(fā)公司);羊抗鼠IgG-HRP(北京中山生物工程公司);BCA試劑盒(PIERCE)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 激光共聚焦顯微鏡(Leica),流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,用含有100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)。以0.5μg/ml的劑量每四天加藥一次維持 HL60/ ADR的耐藥性,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物的負(fù)向免疫誘導(dǎo)與抗血清效價(jià)檢測(cè)取雌性BALB/c小鼠,腹腔注射HL60細(xì)胞(5×106),除對(duì)照組小鼠外20分鐘后腹腔注射Cp(100 mg/kg小鼠體重),此后第24、48小時(shí)等量腹腔注射Cp兩次[1,2]。上述操作隔周重復(fù)一次,于第三次誘導(dǎo)后檢測(cè)動(dòng)物血清效價(jià):取小鼠尾血以PBS稀釋成不同濃度,與 HL60細(xì)胞4℃反應(yīng)1小時(shí),后與羊抗鼠(IgG-FITC)于4℃孵育30分鐘,洗凈二抗。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體與細(xì)胞的結(jié)合百分率及熒光強(qiáng)度,以小于對(duì)照組兩倍的熒光強(qiáng)度為陰性值,血清效價(jià)為對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.2.3 動(dòng)物免疫與細(xì)胞融合 最后一次負(fù)向免疫10天后,小鼠經(jīng)腹腔注射HL60/ADR細(xì)胞(5×106),隔周免疫一次,共3次。取小鼠尾血,分別以HL60和HL60/ADR為靶細(xì)胞檢測(cè)抗血清效價(jià),方法及標(biāo)準(zhǔn)同上。選取以HL60為靶細(xì)胞抗血清效價(jià)最低且以HL60/ADR為靶細(xì)胞抗血清效價(jià)最高的小鼠做加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫以5×106HL60/ADR細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射,隨后進(jìn)行融合和雜交瘤培養(yǎng)[3,4]。

1.2.4 陽(yáng)性克隆篩選及克隆化培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)采用活細(xì)胞間接標(biāo)記法篩選:取細(xì)胞分泌的上清150μl分為兩份,分別與HL60和HL60/ADR為靶細(xì)胞于96孔板中4℃孵育1小時(shí)。棄上清液,PBS洗兩次。加入羊抗鼠IgG-FITC(20μl/孔)4℃反應(yīng)30分鐘,棄上清液,以PBS洗三次,棄上清將每孔細(xì)胞稀釋至400 μl,上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞分泌的上清與HL60和HL60/ADR兩種靶細(xì)胞的結(jié)合百分率。每孔細(xì)胞分泌的上清液檢測(cè)兩次,均符合如下標(biāo)準(zhǔn)可建株:(1)上清液與兩種靶細(xì)胞結(jié)合百分率之比大于2.5倍以上的瘤株; (2)單株靶細(xì)胞結(jié)合率≥30%,兩種靶細(xì)胞結(jié)合率之差≥20%的瘤株。

將符合標(biāo)準(zhǔn)的瘤株進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)和篩選,標(biāo)準(zhǔn)同上。篩選出可持續(xù)穩(wěn)定分泌有差異的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.5 單克隆抗體的制備及純化 腹腔注射雜交瘤細(xì)胞(2×106)于預(yù)先腹腔注射降植烷的BALB/c雌鼠,10～12天后取腹水,采用間接標(biāo)記流式細(xì)胞儀測(cè)定效價(jià)。飽和硫酸銨預(yù)處理后,用蛋白G純化系統(tǒng)純化,分別用SDS-PAGE和BCA試劑盒檢驗(yàn)其純度以及蛋白濃度。

1.2.6 流式細(xì)胞儀及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)單克隆抗體與靶細(xì)胞結(jié)合的差異性 采用FITC間接標(biāo)記,流式細(xì)胞儀檢測(cè)純化抗體與HL60和HL60/ADR的結(jié)合百分率,方法同上。

將HL60、HL60/ADR細(xì)胞懸液涂于載玻片上,以丙酮和甲醇 (1∶1)固定,PBS洗兩遍,以胎牛血清室溫封閉20分鐘,洗兩遍,單克隆抗體4℃孵育1小時(shí),FITC標(biāo)記的羊抗鼠熒光二抗4℃孵育40分鐘, DAPI室溫孵育5分鐘,染細(xì)胞核。PBS洗三遍,用60%甘油封片于激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 抗血清效價(jià) 經(jīng)HL60和Cp三次負(fù)向免疫誘導(dǎo)后,實(shí)驗(yàn)組小鼠抗血清效價(jià)均低于400,對(duì)照組為12 800。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)HL60/ADR三次免疫后,以HL60/ADR為靶細(xì)胞的抗血清效價(jià)均高于以HL60為靶細(xì)胞的抗血清效價(jià),3號(hào)小鼠以HL60/ADR為靶細(xì)胞的抗血清效價(jià)最高,高于12 800(表1)。取3號(hào)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫及融合。

2.2 雜交瘤株的建立及差異篩選 按照上述方法及標(biāo)準(zhǔn)在首次篩選的87株雜交瘤中,我們發(fā)現(xiàn)有39株與 HL60/ADR的結(jié)合率高于 HL60,12株與HL60的結(jié)合率高于HL60/ADR(圖1A,B),有差異的瘤株共51計(jì)株,總差異率為58.62%。將這些抗體進(jìn)行亞克隆培養(yǎng)。經(jīng)三次亞克隆培養(yǎng)、流式細(xì)胞儀交叉篩選后獲得數(shù)株可持續(xù)穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。其中,克隆5F6生長(zhǎng)最快,并且與兩種靶細(xì)胞的結(jié)合百分率差異大,我們首先對(duì)其進(jìn)行亞克隆培養(yǎng),獲得一株雜交瘤細(xì)胞(克隆號(hào)5F6-C5-A12,簡(jiǎn)稱5F6)用于抗體制備及純化。

2.3 單抗5F6的制備及純化 將雜交瘤細(xì)胞5F6接種于BALB/c小鼠腹腔,獲得腹水。飽和硫酸銨預(yù)處理,蛋白G純化系統(tǒng)純化,經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量,其濃度為1.6 mg/ml。SDS-PAGE電泳證明在非還原情況下抗體的分子量約為172 kD,經(jīng)還原后重鏈的分子量約為56 kD,輕鏈的分子量約為29 kD(圖2),純度大于95%。

表1 不同組小鼠的抗血清效價(jià)Tab.1 Titer of antiserum in different mice are represented

圖1 各株雜交瘤所分泌的抗體與 H L60,H L60/ADR兩種靶細(xì)胞的結(jié)合百分率Fig.1 Binding percentage of hybridoma antibodies based FACS assays

圖2 SDS-PAGE分析抗體5F6Fig.2 SDS-PAGEanalysis of monoclonal antibody 5F6

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)單抗5F6與H L60,H L60/ADR的細(xì)胞結(jié)合百分率Fig.3 Binding percentage of McAb 5F6 with H L60/ADRand H L60 cells by FACS

圖4 激光共聚焦觀察單抗5F6識(shí)別細(xì)胞膜抗原Fig.4 Immunofluorescence staining of membrane antigen

2.4 單抗5F6與HL60及HL60/ADR結(jié)合的差異性研究 純化后的單抗5F6分別與 HL60和 HL60/ ADR兩種靶細(xì)胞反應(yīng),經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),證明抗體與兩種細(xì)胞的結(jié)合率及熒光強(qiáng)度有顯著差異(圖3)。激光共聚焦顯微鏡下單抗 5F6與 HL60和HL60/ADR的熒光強(qiáng)度有顯著差異(圖4),說明此單克隆抗體確實(shí)能夠特異結(jié)合于HL60和HL60/ADR兩種靶細(xì)胞,且有明顯的差異。

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)90%以上的腫瘤患者死亡不同程度受到耐藥的影響,這個(gè)難題一直困擾著臨床化療工作。迄今已發(fā)現(xiàn)的腫瘤耐藥的機(jī)制并不能很好的解釋臨床耐藥的現(xiàn)象,其中能應(yīng)用于臨床治療的更是少之又少。血液腫瘤的治療無法依靠手術(shù)切除,因而化療的耐藥問題在血液腫瘤的治療中顯得尤為突出。如何發(fā)現(xiàn)血液腫瘤上耐藥的新靶點(diǎn)和新機(jī)制是血液學(xué)工作者需要迫切解決的問題。

細(xì)胞膜蛋白在細(xì)胞間接觸、表面識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、酶活性和轉(zhuǎn)運(yùn)方面都扮演著重要的角色,是理想的檢測(cè)和治療靶點(diǎn)。但由于細(xì)胞膜蛋白固有的疏水性和復(fù)雜的結(jié)構(gòu),許多膜蛋白很難選擇合適的溶解試劑,這使得直接研究膜蛋白非常困難。如何在血液腫瘤細(xì)胞膜上發(fā)現(xiàn)與耐藥相關(guān)的新靶點(diǎn),進(jìn)一步研究其功能和新的耐藥機(jī)制是本實(shí)驗(yàn)首要突破的問題。

研究表明,由Cp誘導(dǎo)的SI,操作性和重復(fù)性更強(qiáng),其耐受原和免疫原既可以是結(jié)構(gòu)相似的多肽、蛋白質(zhì),也可以是生物學(xué)功能相似的細(xì)胞、病毒等[5,6]。Cp作為一種免疫抑制劑被用于一些免疫過程性疾病和骨髓移植時(shí)的免疫抑制,他可誘導(dǎo)動(dòng)物耐受非自身抗原,這種耐受主要是基于Cp優(yōu)先清除抗原刺激性B細(xì)胞和T細(xì)胞的作用[7]。

HL60敏感株作為耐受原誘導(dǎo)動(dòng)物免疫耐受,理論上受試動(dòng)物應(yīng)耐受敏感株表面抗原,用 HL60/ ADR免疫時(shí)動(dòng)物只對(duì)耐藥株不同于敏感株表面的抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但在實(shí)驗(yàn)中我們篩選到了與敏感株結(jié)合率高于耐藥株的單克隆抗體。在Raymond的研究中[8],這種經(jīng)過消減免疫法制備的抗體優(yōu)先結(jié)合于耐受原的情況也曾出現(xiàn)過。這可能是由于這些單抗所針對(duì)的抗原表位是次要抗原決定簇,因而逃逸了由Cp介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞的抑制。而這些表位同樣存在于免疫原HL60/ADR上,當(dāng)再次接觸到這些表位時(shí),B細(xì)胞依然會(huì)對(duì)這些表位產(chǎn)生免疫應(yīng)答。若這些表位是HL60和HL60/ADR之間的差異表位,針對(duì)他們的單抗在后期的篩選過程中依然會(huì)作為差異抗體被篩選出來。

實(shí)驗(yàn)采用SI方法結(jié)合流式細(xì)胞儀差異篩選抗體的方法,大大縮小了篩選抗體的工作量,縮短了篩選時(shí)間,所篩選到的抗體中按照我們自行設(shè)定的較高的差異標(biāo)準(zhǔn),抗體中敏感株與耐藥株結(jié)合有差異的抗體比率仍可達(dá)到58.6%。我們?cè)谶@些雜交瘤中選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好,與兩種靶細(xì)胞結(jié)合百分率差異大的六株克隆進(jìn)行亞克隆培養(yǎng),最終獲得四株可穩(wěn)定分泌差異性抗體的雜交瘤細(xì)胞,并已穩(wěn)定培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)中,我們從四株已進(jìn)行亞克隆并穩(wěn)定培養(yǎng)的克隆中選取克隆5F6-C5-A12進(jìn)行抗體的制備和純化以及細(xì)胞結(jié)合功能的實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀和激光共聚焦顯微鏡分別在數(shù)量和形態(tài)驗(yàn)證并鑒定了單抗5F6所識(shí)別的HL60和HL60/ADR上的抗原的差異性。本實(shí)驗(yàn)未對(duì)5F6進(jìn)行Ig亞類的鑒別。在以后的實(shí)驗(yàn)中,我們將對(duì)其亞類進(jìn)行鑒別,并用合適的方法進(jìn)一步鑒定其抗原,研究抗原的作用機(jī)制。通過5F6的初步試驗(yàn),我們相信,所篩選得到的這些抗體可作為日后檢測(cè)和治療腫瘤耐藥的候選抗體,成為相關(guān)研究的有益工具,而相應(yīng)的抗原則可能成為腫瘤多藥耐藥相關(guān)研究的新靶點(diǎn)。

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[收稿2009-07-18 修回2009-09-14]

(編輯 張曉舟)

Production of discrepant monoclonal antibody against HL60 and HL60/ADR by SI technique

REN Si-Mei,YU Yun,SHE Ming,SHAO Xiao-Feng,SHI Rui-Zan,PENG Hong-Wei,LIN Yang,ZHANG Xiu-Li,
ZHANG Yan-Jun,XIONGDong-Sheng.State Key Laboratory of Experimental Hematology,Institute of Hematology,CAMS&PUMC, Tianjin300020,China

Objective:T o prepare and characterize specific and discrepant mouse hybridoma antibodies on membrane of HL60 and HL60/ADR cell lines.Methods:BALB/c mice were immunized by subtractive immunization induced Cp(Cyclophosphamide).McAbswere prepared by hybridoma technique,screened and detected by FACS and LSCM.Results:51 candidates and discrepant antibodies were found,and one of them(5F6)was purified and identified.Conclusion:Combination of SI with discrepant screening method should facilitate the preparing and identifying discrepant McAbsfor identifying antibodies that can distinguish the differences in proteins expressed in HL60 and HL60/ADR, which is a significative and potential method in the research and target therapy associated drug-resistance.

Subtractive immunization;Tumor drug resistance;McAb;Discrepant protein

R392.33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-484X(2010)02-0160-04

①本文受國(guó)家自然科學(xué)基金(30873091、30971291)和天津市科技發(fā)展項(xiàng)目(05YFGZGX02800 08ZCGHHZ00900)資助

②南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南京210029

任思楣(1981年-),女,在讀博士,主要從事腫瘤藥理學(xué)方面的研究,E-mail:simei-ren@163.com;

及指導(dǎo)教師:熊冬生(1961年-),男,教授,博士生導(dǎo)師主要從事腫瘤多藥耐藥和基因工程抗體方面的研究,E-mail:dsxiong1961@yahoo.com.cn。