輔酶依賴型和不依賴型甘油脫水酶的比較

楊仲麗,方柏山,余勁聰,王慶花,李梓君

(華僑大學工業生物技術福建省高等學校重點實驗室,福建泉州362021)

輔酶依賴型和不依賴型甘油脫水酶的比較

楊仲麗,方柏山,余勁聰,王慶花,李梓君

(華僑大學工業生物技術福建省高等學校重點實驗室,福建泉州362021)

實驗比較源自肺炎克氏桿菌(K.pneumoniae)和丁酸梭狀芽孢桿菌(C.butyricum)中的甘油脫水酶(GDHt)的輔酶依賴特性.采用生物信息學的方法,對兩種酶的異同點進行分析,發現兩種酶結構上相似性較低、親緣性較遠、分屬于兩個不同的家族.SMART數據庫搜索結果表明,C.butyricum中不依賴輔酶的甘油脫水酶及其再激活酶,分別屬于gly-Radical和Radical-SAM家族,多序列比對得到的一段富含半胱氨酸殘基C＊＊C＊＊C的保守序列正是其共同特征.

肺炎克氏桿菌;丁酸梭狀芽孢桿菌;輔酶;甘油脫水酶;維生素B12;依賴性

甘油脫水酶(GDH t)是微生物發酵法生產3-羥基丙醛(3-HPA),進而生產1,3-丙二醇(1,3-PD)過程中的重要限速酶之一.在已發現能發酵甘油,產生1,3-丙二醇(1,3-PD)的微生物中[1],克氏肺炎桿菌(K.pneum oniae)和丁酸梭狀芽孢桿菌(C.butyricum)具有較高的1,3-PD轉化率及生產強度,是研究得比較多的兩種菌[2].K.pneumoniae以甘油為底物發酵生產(3-HPA)的一個關鍵的限制點,是編碼一種依賴輔酶B12的甘油脫水酶,即需要在培養基中額外地加入維生素B12.C.butyricum具有良好的1,3-PD耐受力,且其發酵過程具備對輔酶B12的不依賴性.該菌屬于嚴格厭氧菌,在實驗室培養條件苛刻,而在工業培養中方便.對于C.butyricum中甘油脫水酶不依賴輔酶的報道[3-5],使得該種甘油脫水酶催化機制的研究成為新的熱點.本文比較源自K.pneumoniae和C.butyricum中GDHt對輔酶B12的依賴性,并從生物信息學角度找出輔酶依賴型和不依賴型甘油脫水酶的異同點.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)菌株.肺炎克氏桿菌(K.pneumoniae,DSM 2026),丁酸梭狀芽孢桿菌(C.butyricum, VPI1718),由德國生物技術研究中心惠贈.(2)試劑.輔酶B12,鹽酸3-甲基-2-苯并咪唑酮腙(MBTH),購自美國Sigma公司;其余試劑均為國產分析純.(3)生物學數據庫.NCB I,PDB,SM ART等.(4)應用軟件.Cluster X,Molsoft ICM-Pro,Phylip等.

1.2 方法

1.2.1 GDH t的酶活測定方法 (1)預處理.將保存于-20℃的K.pneumoniae和C.butyricum經過活化、擴大培養和發酵后,離心收集菌體,并采用超聲波細胞破碎法(1 s內超聲0.6 s,間歇0.4 s)破碎;然后,將離心懸浮液,上清液即為無細胞抽提液,用于酶活性分析.其中,C.butyricum培養的整個過程都在嚴格厭氧條件下進行.

(2)測定方法.GDHt催化甘油脫水生成的醛類,其與MBTH反應形成的復合物可用紫外分光光度法進行測定.采用Toraya等建立的MBTH(3-甲基-2-苯并噻唑腙煙酸鹽)法測定GDHt的活性.

(3)反應體系.適量無細胞抽提液,0.12 mol·L-1甘油,0.035 mol·L-1磷酸鉀緩沖液,0.05 mol·L-1KCl,選擇性地添加15μmol·L-1輔酶B12,總體積為1 m L.在37℃下反應一定時間后,加入1 m L的0.1 mol·L-1檸檬酸鉀緩沖液(p H=3.6)以終止反應;然后,加入0.5 mL的0.1%MBTH,于37℃下保溫15 m in,加入1 m L水,于305 nm下測定其吸光度值.

1.2.2 生物信息學比較 (1)一級結構比較.從生物數據庫NCBI上搜索得到輔酶依賴型和不依賴型GDH t的氨基酸序列,K.pneum oniae中GDHt氨基酸序列的NCB I登陸號為U 60992,C.butyricum中GDHt的NCBI登陸號為A Y112989.利用NCBI數據庫的BLAST(兩條序列對齊)功能(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),提交輔酶依賴型GDH t的α,β,γ亞基和不依賴型GDH t及其再激活酶基因序列;搜索其相似序列和區域,并對輔酶不依賴型GDHt的整個數據庫進行相似性分析.在此基礎上,選取相似性較高的幾條序列,利用Cluster X軟件進行多序列比對,以尋找保守區域.

(2)蛋白質結構域搜索.利用SMART數據庫搜索GDHt及其再激活酶結構域,所得結構域同時提供相關連接,如結構域功能、分布范圍,以及是否具有已知空間結構.

(3)酶分子空間結構的重疊分析.從PDB數據庫上搜索并下載輔酶依賴型和不依賴型GDHt的晶體結構,K.pneumoniae中GDH t晶體結構的PDB登陸號為1MM F,C.butyricum中GDH t晶體結構的PDB登陸號為1R9D.利用Molsoft ICM-Pro軟件對其3級結構進行空間位置的重疊,以衡量其空間構象的相似性.

(4)酶的親緣性分析.利用軟件Phylip,建立包括K.pneumoniae和C.butyricum的GDH t在內的進化樹,分析兩者親緣性.

圖1 氧氣對C.butyricum中GDH t酶活的影響Fig.1 Effect of oxygen on the activity of GDHt from C.butyricum

2 結果與討論

2.1 GDHt輔酶依賴性的比較

在有氧條件下,分別測定添加與不添加輔酶的GDHt酶活,結果如圖1所示.實驗發現,K.pneum oniae中GDH t在輔酶B12存在下,表現出的酶活為13.70 μkat·L-1,而不添加輔酶則沒有活性,反應10 min后終止.由于C.butyricum中GDH t對氧氣較敏感,所以在有氧條件下測量其酶活時需通入去氧劑.

在不同的反應終止時間,發現隨著GDH t在氧氣中暴露時間越長,酶活喪失越多(終止時間為1 min時,可近似看作厭氧).從圖1可看出,C.butyricum的GDHt在添加與不添加輔酶B12時,酶活相差較小.

2.2 一級結構的序列分析

在NCB I服務器上使用BLAST程序中的BLOSUM 62矩陣,空位開放罰分和空位擴展罰分分別為11和1,對兩序列進行對齊分析,結果如圖2所示.圖2顯示,此兩條序列間沒有相似的序列及區域.

圖2 兩條序列對齊結果Fig.2 Alignment of the two sequences

利用綜合性軟件Molsoft ICM-Pro計算輔酶依賴型GDHt的α亞基和不依賴型GDHt完全對齊時相同堿基僅為19%,結果如圖3所示.由于兩序列同源性較小,而輔酶依賴型GDH t的催化機制已得到較透徹的研究,在此,以不依賴型GDHt為探索的重點.

圖3 Molsoft ICM-Pro計算兩序列的同源性結果Fig.3 Calculation of homology between the two sequences by Molsoft ICM-Pro

在NCBI服務器上使用BLAST程序,從SW ISS-PORT蛋白質序列數據庫中搜索輔酶不依賴型GDHt的相似序列,結果如圖4所示.圖4中列出的最高分值的擊中項,每一行顯示一條蛋白質序列.從左到右依次是數據庫編號、序列名稱、序列長度,然后是兩個僅與技術有關的分值,末尾行是閥值E, E值由高到低.搜索使用的是BLOSUM 62矩陣,空位開放罰分和空位擴展罰分分別為8和2,其中設定閥值E為0.1.

圖4 輔酶不依賴型GDHt對庫檢索結果Fig.4 Retrieval of B12-independent GDHt in the NCB Idatabase

由圖4可看出,來自不同菌種的PFL序列聯配分值較高.選取幾種同源性較高的酶,利用ClusterX軟件進行多序列比對.找出圖5所示的保守區域,其中富含半胱氨酸殘基.活性中心的半胱氨酸殘基遇氧容易形成S-S鍵,失去轉移電子的能力.這可能是該酶對氧氣較敏感.

K.pneumoniae中的GDHt是6個亞基α2,β2,γ2,通過非共價鍵的疏水相互作用締合成的異六聚體,其中兩個α,β,γ異型三聚體組成了一個對二聚體.α亞基含一個丙糖磷酸異構酶(TIM)桶狀結構,把活性中心圍在中間.B12位于TIM桶狀結構和β亞基之間,如圖6所示[6].

C.butyricum中的GDH t是一個由單亞基通過非共價鍵的疏水相互作用締合成的二聚體,它的兩個單體呈幾乎完美的中心對稱,其單體由10個β/α桶狀結構組成,氨基酸C端(黃色標記)作為高度保守區,是與再激活酶結合的位點,如圖7所示[7].從圖6,7可看出,輔酶不依賴型GDH t在氧氣中暴露時間越長,酶活喪失越多.其中,DhaB為輔酶不依賴型GDH t基因,PflC,TutE,N rdG的NCB I登陸號分別為Ec(P32675),T1(AAC38452),Ec(P39329).

圖7 C.butyricum甘油脫水酶的晶體結構 Fig.7 Crystal structure of GDHt from C.butyricum

圖6 K.pneumoniae甘油脫水酶的拓撲結構圖Fig.6 Opology of GDHt from K.pneumoniae

圖5 ClusterX多序列比對搜索到的保守區域Fig.5 Conserved region found by multip le sequence alignments

2.3 蛋白質結構域的搜索結果分析

在SMART搜索到的輔酶不依賴型GDH t的結構域,如表1所示.從表1可知,該蛋白有一段相似于PFL家族的結構域和一段gly-Radical結構域.搜索輔酶不依賴型GDHt的再激活酶(GDH t-AE)時,發現其屬于“Radical-SAM”家族,如表1所示.

Heidi等[8]指出,這一家族的成員均可催化一系列不依賴輔酶的化學反應,但是每一種酶根據底物不同而需要不同的輔因子,并有著相同的催化機理.在搜索輔酶依賴型GDHt時,未發現有顯著的結構域.

2.4 三級結構重疊分析

利用Molsoft ICM-Pro軟件,對輔酶依賴型和不依賴型GDH t的3級結構進行最大限度重疊,結果如圖8(a)所示.雖然兩者都為二聚體,但是空間結構相差較大,重疊部分較少.

引入均方根偏差DRMS作為衡量重疊效果的參數,DRMS越大,重疊部分越少.兩者重疊的DRMS值為27.104 749.作為比較,同時重疊來自Clostridium novyi的PFL與不依賴型GDHt,兩者相似性為78%,DRMS為9.607 466,如圖8(b)所示.

2.5 進化樹的建立

選擇兩種酶對庫檢索時產生的序列,利用Phylip軟件生成進化樹,如圖9所示.圖9中,黑框標記為K.pneum oniae和C.butyricum中GDHt.從圖9可看出,輔酶不依賴型GDHt與一類PFL及同樣不依賴輔酶的GDHt有較近的親緣性,同屬于Radical-SAM家族[4,9].

表1 SMART的結構域搜索結果Tab.1 Domains of GDHt found by SMART

圖8 三級結構重疊結果Fig.8 Overlapping of tertiary structures

圖9 兩種GDH t的進化樹分析Fig.9 Analysis of the phylogenetic tree of the two enzymes

從多序列比對得到的一段C＊＊C＊＊C看出,此結構域與Layer等[10]報道的Coproporphyrinogen-Ⅲoxidase中與[4Fe-4S]簇匹配的3～4個彼此間隔的半胱氨酸殘基基團C＊＊C＊＊C匹配.因此,推測輔酶不依賴型GDH t借助SAM斷裂所產生的活性5’-脫氧腺苷自由基替代B12起作用;而輔酶依賴型GDHt與一類同樣依賴輔酶B12的GDHt親緣性較近.當輔酶B12與GDHt結合時,其Co-C鍵發生均裂,產生一個5’-脫氧腺苷自由基團,引發一系列電子轉移催化反應[11],而兩者之間親緣性較遠.

綜上所述,來自K.pneumoniae中依賴輔酶B12和C.butyricum中不依賴輔酶,其甘油脫水酶相似性較低.從兩序列的對齊結果看,兩條序列同源性較低.從SMART搜索結果可看出,C.butyricum中不依賴輔酶的甘油脫水酶及其再激活酶分別屬于gly-Radical和Radical-SAM家族,多序列比對得到的一段富含半胱氨酸殘基C＊＊C＊＊C的保守序列正是其共同特征.

因此,B12-independent GDH t的催化機制同于Radical-SAM家族其他成員,即借助S-adenosylmethionine代替輔酶B12起作用.

3 結束語

研究結果可為C.butyricum中的甘油脫水酶基因工程改造,得到兼性厭氧,產不依賴輔酶的GDHt提供理論依據.下一步研究是,通過定點突變等技術,改造此保守區域的半胱氨酸殘基,使其在具備穩定酶活的同時對氧氣有一定的抵御能力.

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Com parison between the B12-Dependen t and Independen t Glycerol Dehydratase

YANG Zhong-li,FANGBai-shan,YU Jin-cong, WANG Qing-hua,L IZi-jun
(Key Laboratory of Industrial Biotechnology Fujian Province,Huaqiao University,Quanzhou 362021,China)

In this paper,the coenzyme B12dependence of glycerol dehydratase between Klebsiella pneumoniae and Clostridia butyricum was compared.Their differences and similaritieswere analyzed w ith bioinfo rmatics.Results showed that these two enzymes belonged to two different familiesw ith low similarities.Searching the SMART database and the result also show s that the B12-independent glycerol dehydratase from Clostridia butyricum and its reactivate enzyme belong to gyl-Radical family and Radical-SAM family respectively,and the conserved sequence w hich is rich in half-cysteine obtained by multip le alignments is their common feature.

Klebsiella pneumoniae;Clostridia butyricum;coenzyme;glycerol dehydratase;vitamin B12;dependence

Q 55

A

(責任編輯:黃曉楠 英文審校:劉源崗)

1000-5013(2010)05-0542-06

2009-02-11

方柏山(1957-),男,教授,主要從事合成生物學的研究.E-mail:fangbs@hqu.edu.cn.

國家高技術研究發展(863)計劃項目(2006AA 020103);國家自然科學基金資助項目(20676048, 30770059)