Flt3基因突變與急性髓系白血病發生和預后的關系

王杰

(沈陽醫學院基礎醫學院生物化學教研室,遼寧 沈陽 110034)

Fms樣酪氨酸激酶 3(Fms-like tyrosine kinase 3,Flt3)是Ⅲ型受體型酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinase,RTK)家族成員之一,在正常造血及免疫系統發育中起著重要作用。Flt3基因突變與急性髓系白血病 (acutemyelogenous leukemia,AML)的發生、預后密切相關。以 Flt3作為靶分子已成為 AML治療的一種新策略。

1 Flt3基因結構與功能

1.1 結構 人類 Flt3基因又稱作胎兒肝臟激酶-2(Fetal liver kinase-2,FLK-2)[1]和人類干細胞激酶-1(human stem cell kinase-1,STK1)[2],位于染色體 13q12,全長約 100 kb,含有 24個外顯子,編碼 993個氨基酸的蛋白質。Flt3蛋白有分子量為143KD的糖基化高甘露醇形和分子量為 158KD的復合糖形兩種形式,前者存在于胞內,經過糖基化過程后形成后者,并定位于膜上。后者是 Flt3在細胞表面的主要存在形式。

Flt3與其它Ⅲ型 RTK如 kit、fms、PDGF受體有相似的結構,包含由胞外區、跨膜區和胞內區 3部分組成。胞外區是胞外配體結合區,由 5個免疫球蛋白樣結構域組成;跨膜區有不連續的激酶作用的位點;胞內區為酪氨酸激酶催化區,由 1個胞內近膜結構域 (juxtamembrane domain,JM)、2個被插入結構域分開的激酶結構域 (tyrosine kinase domain,TKD)和 1個 C末端 -結構域構成[3]。近年來的研究表明 JM結構域對維持激酶催化中心空間結構穩定性起主要作用,對激酶活性有負調控作用[4]。

圖 1 Flt3信號轉導途徑

1.2 功能 Flt3在胸腺、肝、脾、淋巴結、胎盤、大、小腦、生殖腺等多種組織中表達。在正常人骨髓中 Flt3的表達僅限于 CD34+干/祖細胞,在紅細胞系及成熟 T、B淋巴細胞、NK細胞中無表達[5]。Flt3配體為 FL(Flt3 ligand)。無 FL存在時,近膜結構域對 Flt3二聚體形成和活化起著抑制作用。當 FL與 Flt3受體結合,后者發生二聚體化,激酶結構域的活化環 (activation loop,A-loop)構象發生改變,酪氨酸殘基自身磷酸化。激活的 Flt3通過 SHC與 GRB2結合而激活 RAS,從而進一步激活下游的效應因子如 RAF、MAPK/ERK激酶。這些下游效應因子激活核因子 CREB、ELK、STATs,使造血干細胞發生增殖和活化。此外,激活的 Flt3也可以激活 PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)和 RAS途徑,導致增殖加快,細胞凋亡抑制[6],見圖 1。這兩種信號途徑通過 RAS的聯系提示了 Flt3與白血病發生有關。

2 Flt3基因突變

Flt3基因突變是造成 Flt3基因異?；罨闹饕?。其突變形式主要表現為兩種：近膜結構域內部串聯重復 (internal tandem duplications,ITDs)突變和 TKD或/和 JM的點突變 (pointmutation,PMs)。兩種突變均可造成 Flt3酪氨酸激酶的結構性活化,見圖 2。

圖 2 Flt3基因突變常見類型

Flt3/ITDs是 Flt3基因 AML中最常見的突變類型,常出現在外顯子 11,也可累及內含子 11和外顯子 12[7]。也有報道 Flt3/ITD位于外顯子 14和15,而非外顯子 11和 12[8-10]。Flt3/ITDs的插入長度具有多態性,其長度在 3～400bp之間不等,但串聯復制的堿基數多是 3的倍數,極少產生框移突變,因而不影響開放閱讀框架 (open reading frame,ORF)的正常翻譯過程[11,12]。Flt3/ITDs使得 Flt3基因持續活化的原因可能的是：(1)Flt3/ITDs造成了近膜結構域的結構改變,從而破壞了近膜結構域的自我抑制功能[13]。(2)Flt3/ITD突變可以使細胞外的 C末端的構象發生變化,有利于 Flt3二聚體的形成,導致配體非依賴性磷酸化。Flt3因磷酸化而酪氨酶激酶活性增強,導致酪氨酸殘基自發激活發生磷酸化作用,激活下游信號通路,如 RAS信號轉導途徑和轉錄激活因子 5信號轉導途徑,促進細胞增殖并與 AML的進展存在密切相關[14],見圖 3。

圖 3 Flt3基因突變信號轉導示意圖

在一些無 Flt3/ITDs的 AML患者中也存在配體非依賴性的 Flt3基因組成性激活,說明除 Flt3/ITDs之外,可能還存在有其他類型突變導致 Flt3基因激活。近年來國內外的研究表明約 6.4%～7.7%的患者出現 TKD或/和 JM結構域的點突變,同樣可以導致 Flt3基因配體非依賴性激活[15,16]。

TKD點突變,常發生于激酶結構域Ⅱ活化環內,通常為氨基酸殘基的突變,插入和缺失,最常見的是 D835是第一個核苷酸 G被 T替代,即D835Y[17]。此外還有 D835V[18]、D835H[19]、D835E[20]、D835N[21]等。最近,在 AML中又發現了兩種新的活化環點突變,一種是第 836位 I的缺失,另一種是第 836位 I被 M替換同時被 R插入[22]。這兩種新的點突變與 D835一樣,突變也位于第 2個酪氨酸激酶的活化環內,都能導致無配體情況下受體自身磷酸化,通過激活 STAT5信號轉導途徑而抑制白血病細胞的凋亡[23]。

JM點突變發生頻率不高,目前尚無大量的臨床研究統計學數據。已見報道的突變類型有V579A、V592A、 F594L和 F590GY 591D等[24,25]。研究表明 JM點突變可以降低 JM區對激酶活性負調節作用,從而使 Flt3持續活化并激活下游信號途徑,如 STAT5[26]。研究也發現 JM點突變與Flt3/ITDs相比,對細胞的增殖作用較小,且受體自身的活化程度也較弱,推測可能是 JM點突變對近膜結構域的破壞較小,未造成自我抑制功能的完全喪失[27,28]。

3 Flt3基因突變與 AM L

急性白血病是兒童最常見的惡性腫瘤,發病率為 3/10萬,其中 AML約占 20%～30%。近幾年來,隨著環境致癌因素的增加,AML的發病率及死亡率均呈上升趨勢。目前 AML的發生機制仍未完全闡明,但隨著研究的不斷深入,Flt3基因突變在 AML發生、預后中的作用日益受到重視。

3.1 Flt3基因突變與 AML發生 Flt3與其配體FL結合后能通過信號傳導途徑對造血發育起重要的調控作用,能調節多能造血干細胞、早期前體細胞及不成熟淋巴細胞的生長。1996年,Nakao等首先報道 AML患者 Flt3基因編碼的近膜區(JM)存在 Flt3/ITDs[29]。此后的國內外報道顯示Flt3基因在 70%～90%的 AML患者細胞中出現異常表達,其中 20%～25%的 AML患者 Flt3基因發生了 Flt3/ITDs,并見于 AML各亞型,其中以 M3和 M 5多見,且突變率各異[30]。我們的研究發現在兒童白血病患者中 Flt3陽性率 80.33%,其中Flt3/ITDs突變率為 17.21%;各亞型突變率分別為 M0 42.86%、M1 22.22%、M2 12.90%、M4 44.44%和 M5 15.38%。說明兒童 AML在外顯子11處發生 Flt3/ITDs的頻率極高,是兒童 AML發生的主要原因[31]。

目前,Flt3異常表達和基因突變導致 AML發生的分子機制尚不完全清楚。目前大量的臨床研究證實 Flt3/ITDs常集于 JM區中從密碼子 589～599富含酪氨酸殘基的一段區域,從首尾相按順序插入若干個復制的核苷酸。研究顯示在 AML細胞株研究中,Flt3/ITDs可抑制 c/EBPa(repression of CCAAT/estradiol-binding proteinα)和 Pu.1的表達,阻滯髓源細胞分化;應用 Flt3/ITDs抑制劑處理 AML細胞株后 c/EBPαPu.1表達增強[32]。進一步的研究證實 Flt3/ITDs可干擾激酶磷酸化信號通路,使 STAT5(singal transducer and activator of transcrip tion 5)活化增強以及 c/EBPα和 Pu11表達抑制[33]。說明Flt3/ITDs有利于 Flt3二聚體的形成,引起配體非依賴性磷酸化,在 AML的發病機制中起重要作用。

3.2 Flt3基因突變與 AML預后 近年來大量臨床研究表明,Flt3/ITDs與 AML預后密切相關。Gale等[30]的結果顯示 Flt3/ITDs突變陽性 AML患者與陰性組比較外周血 WBC計數顯著增高,CR率顯著降低,化療相關死亡率高,復發危險增高,無病生存率、無事件生存率及總生存率均顯著降低。我們采用 PCR方法聯合序列檢測伴有或不伴有染色體易位的 AML患者 Flt3基因突變情況,結果顯示：46例伴有染色體易位患者 Flt3基因表達陽性率 67.39%,其中 Flt3/ITDs陽性率分別為26.09%;伴有染色體易位 Flt3/ITDs陽性患者外周血白細胞、血紅蛋白、血小板、骨髓粒細胞比例雖與不伴有染色體易位 Flt3/ITDs突變陽性患者基本相似,但平均生存時間明顯降低,僅為 (8.9±1.5)個月[34]。如 Flt3/ITDs陽性行自異體基因造血干細胞移植的 AML患者無病生存率明顯提高[35]。提示 Flt3/ITDs既可作為預測 AML預后的一個重要指標,也可以指導臨床治療。

3.3 Flt3基因突變與 AML微小殘留病灶檢測 隨著急性白血病化療方案的改善和造血干細胞移植的進展,急性白血病的完全緩解 (CR)率明顯提高。然而仍有許多 CR患者在數年內復發,其主要原因是血液學 CR后體內仍殘留 106-109白血病細胞,稱為微小殘留病 (minimal residual disease,MRD)?，F在普遍認為 MRD是血液學 CR乃至持續完全緩解 (CCR)期間白血病復發的根源。近年來分子生物學技術的發展,為常規骨髓形態學檢查難以檢測的 MRD提供了新方法,然而目前尚缺乏合適的 MRD的檢測指標。Flt3/ITDs是與AML發生及預后相關的一種重要因子,可望成為MRD檢測的重要標志物。

Schnittger等[36]分析1 003例 AML患者,對 34例 Flt3/ITDs陽性患者進行多次檢測 Flt3/ITDs后認為大部分患者 Flt3/ITDs為唯一可檢測的標志,且與臨床階段、FISH、PCR結果有較好的相關性,4例復發患者檢測 Flt3/ITDs比其他方法提前 2～3個月檢測到復發,認為 Flt3可作為 MRD檢測標志。我們用 Flt3基因作為 AML的分子標志,通過PCR技術跟蹤了 AML完全緩解后的 MRD,結果表明：PCR技術檢測 Flt3基因的最低檢出值為 100 pg;Flt3基因陽性 AML患者,經標準治療后,半數左右的患者達到 CR,其中絕大部分患者 Flt3基因表達減弱或轉為陰性;AML患者達 CR后 Flt3基因表達持續陽性或轉陰后再次出現陽性,提示將發生復發[37]。說明在完全緩解期追蹤檢測 Flt3并分析其變化極為重要,Flt3轉為陰性或長期持續陰性者預示能獲得長期無病生存。

4 結語

Flt3基因突變是 AML中最常見的基因異常,與 AML發生有著密切關系。Flt3/ITDs有望成為一種新的生物標志物,用于 AML預后不良和 MRD判定,并可能成為 AML治療的新靶點。

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