SD大鼠與Wistar大鼠腦膠質瘤動物模型的建立及比較

王曉武，李康樗，丁桂榮，徐勝龍，周詠春，譚 娟，常英娟，郭國禎

(1.第四軍醫大學軍事預防醫學系放射醫學教研室，西安 710032; 2.第四軍醫大學西京醫院放射科，西安 710031)

研究報告

SD大鼠與Wistar大鼠腦膠質瘤動物模型的建立及比較

王曉武1，李康樗1，丁桂榮1，徐勝龍1，周詠春1，譚 娟1，常英娟2，郭國禎1

(1.第四軍醫大學軍事預防醫學系放射醫學教研室，西安 710032; 2.第四軍醫大學西京醫院放射科，西安 710031)

目的 比較利用SD大鼠、Wistar大鼠建立腦膠質瘤動物模型的不同，為研究腦膠質瘤的發病機制及治療方法提供操作平臺。方法利用立體定向儀建立 SD大鼠、Wistar大鼠大腦皮層接種C6細胞(2.5×105個細胞/只)，建立腦膠質瘤動物模型，利用組織病理學、免疫組織化學以及核磁共振成像等技術，比較兩種動物模型在成瘤率、腫瘤生長狀況、死亡率以及動物一般情況等方面的異同。結果SD大鼠組、Wistar大鼠組的成瘤率均為100%，兩組均未見轉移;但SD大鼠組腫瘤成瘤時間較長，且部分腫瘤有自愈傾向，而Wistar大鼠組則未出現類似情況。結論Wistar大鼠大腦皮層腦膠質瘤動物模型的腫瘤性狀更接近于人的腦膠質瘤，因此更適合探索和研究腦膠質瘤的發病機制和治療方法;而SD大鼠的腫瘤由于性狀類似轉移瘤，且有自愈傾向，不適合作為上述相關研究的動物模型。

腦膠質瘤;模型，動物;SD大鼠;Wistar大鼠

腦膠質瘤是一種常見的顱內惡性腫瘤，惡性程度高，預后差，臨床平均生存期少于一年。目前，各種治療效果不佳，因此有必要建立合適的膠質瘤動物模型以便進一步研究腦膠質瘤發病機制及治療方案。本文將大鼠C6腦膠質瘤細胞接種在SD大鼠、Wistar大鼠大腦皮層，建立兩種腦膠質瘤動物模型，通過采用病理學及影像學觀察，比較兩種動物模型的差異，為提供合適的腦膠質瘤動物模型提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 人腦膠質瘤C6和實驗動物:C6腦膠質瘤細胞來源于第四軍醫大學神經生物學教研室。實驗動物:Wistar大鼠，雄性，體重150～160 g，共20只，大腦皮層接種 C6細胞。SD大鼠，雄性，體重210～220 g，共20只，大腦皮層接種 C6細胞。SD大鼠、Wistar大鼠均購于第四軍醫大學實驗動物中心［SCXK(軍)2007-007，SYXK(軍)2007-020］。

1.1.2 儀器和試劑:儀器主要包括CO2孵箱(日本理化工業株式會社)，超凈工作臺(天津市特斯泰儀器有限公司)，臺式離心機(湘儀離心機儀有限公司)，腦立體定向儀(西安西北光電儀器廠)，牙科臺式電鉆車(上海齒科醫械廠)，25 μL微量注射器(上海濟成分析儀器有限公司)，簡易手術包，顯微鏡(Nikon)，核磁共振儀(西門子公司);試劑主要包括新生牛血清(天津灝洋生物制品科技有限責任公司)，DMEM培養液(Gibco公司)，兔抗鼠膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)多克隆抗體(博奧森公司)，SABC(中杉公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物準備:動物于接種細胞前開始進行適應性飼養1周，動物體重增加35±3 g。

1.2.2 C6細胞準備:C6復蘇后，在接種前至少傳代一次，待細胞長至對數生長期時(2/3培養瓶底長滿)收集細胞(于收集細胞前24 h更換培養液)。收集細胞時，先用0.01 mol/L PBS洗滌一次，再用0.25%胰酶消化，并于顯微鏡下觀察細胞狀態，待細胞收縮變圓，且有個別細胞脫落時加入少量含10%血清的DMEM培養液終止消化，棄去液體后，加入不含血清的DMEM培養液，收集細胞，800 r/min離心4 min，采用血球計數器計數，制備2.5×107/mL細胞懸液，置于37℃ CO2孵箱中待用。

1.2.3 動物麻醉及準備:大鼠經 10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)經腹腔麻醉后，固定于西安西光儀器廠生產大鼠腦立體定向儀。動物頭部固定于立體定向架，兩耳錘深入外耳道對稱固定，剪去頭頂部毛發約1.0 cm×1.0 cm，碘酒、75%乙醇消毒皮膚后鋪孔巾，無影燈聚焦于種植部位。

1.2.4 顱骨鉆孔及顱內C6細胞接種:根據文獻報道［1－3］，確定接種靶點，在內眥連線與頭部矢狀中線交匯處縱向切口1.0 cm，分離皮膚暴露顱骨，在前囟位置，向右旁開3.0 mm，冠狀縫前0.5 mm坐標定位鉆孔至硬膜，孔徑1.0 mm。25 μL微量注射器吸入吹打混勻的細胞懸液(密度為2.5×107/mL，2.5×105個細胞/只，體積為10 μL)，硬膜下進針3 mm，退1 mm，顱內注射速度為2 μL/min，注射完畢留針 5 min，緩慢拔針。骨孔用骨蠟封閉，術野用0.9%NaCl沖洗后縫合切口。術后單籠飼養。

1.3 實驗觀察指標

1.3.1 接種后動物處理及一般情況觀察:大鼠接種后置籠自然蘇醒，常規飼養，連續7 d皮下注射青霉素;每天觀察動物的進食、飲水、運動及精神等狀態;記錄死亡時間;每2天稱重1次。

1.3.2 大鼠腦MRI檢查:在接種后2周和3周實驗動物做核磁共振成像(MRI)檢查，活體觀察腫瘤的生長情況。用Magnetom Ttio Tim(德國)超導3.0 Tesla成像系統(陜西西安西京醫院核磁室)，冠狀、矢狀及橫斷面T1加權(TR:4500 ms，TE:87 ms)掃描，層厚2 mm，Image matix:259×384。T2W1加權掃描。測量不同瘤齡腫瘤的最大左右徑和上下徑，計算不同瘤齡的腫瘤體積。

1.3.3 組織病理學檢查:大鼠用10%水合氯醛麻醉后，經左心室快速灌注 0.9%NaCl，再灌注 4℃4% 多聚甲醛。取出全腦后，按大鼠腦表面的接種穿刺點為中心做冠狀切口，觀察腫瘤生長情況。并全面檢查有無肺、肝臟及腦內腫瘤轉移。腫瘤組織取出后置于4% 多聚甲醛在4℃后固定3～4 d。組織標本經脫水、包埋后取3 μm切片，HE染色。

1.3.4 組織病理學檢查:腫瘤石蠟切片經脫蠟后進行膠質酸性纖維蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫組織化學染色。一抗為兔抗大鼠GFAP (1∶150)，二抗為羊抗兔(即用型)。觀察GFAP在C6腦膠質瘤中的表達以確定C6膠質細胞源性腫瘤的特性。

2 結果(圖2～7見彩插1)

2.1 一般情況觀察

成瘤率:SD大鼠和Wistar大鼠腦內接種C6腦膠質瘤細胞的成功率均為100%(20/20)。兩組動物于接種細胞后，第3天自行進食，飲水、飲食較接種細胞前減少，體重下降，反應遲鈍。SD大鼠組于接種細胞后約1周情況好轉，體重趨于平穩，并于細胞接種約2周時體重出現增加趨勢;而Wistar大鼠組體重恢復較慢，在接種后2周時大多出現神經系統癥狀，有的表現為狂躁，有的出現向上觀望的癥狀。體重結果見圖1。

圖1 SD大鼠和Wistar大鼠腦膠質瘤模型建立后體重變化Fig.1 Changes of body weight after establishment of SD rats and Wistar rats of cerebral glioma model

死亡率:觀察腦內接種 C6腦膠質瘤細胞至30 d，SD大鼠組未出現死亡，Wistar大鼠組有2只死亡(分別于接種細胞第16天、第19天死亡)，死亡率為10%。

2.2 大體標本及HE染色

SD大鼠組、Wistar大鼠組大體標本觀察，C6細胞以接種點為中心，在大腦皮層處呈團塊狀生長，腫瘤形狀呈不規則形或橢圓形。SD大鼠組有包膜，邊界較清楚;Wistar大鼠組無包膜，腫瘤組織向周圍腦組織浸潤性生長。兩組均未發現轉移瘤。

HE染色結果顯示，兩個品系的接種大鼠腫瘤細胞均生長活躍，異型性明顯，可見病理性分裂相。SD大鼠組腫瘤組織與正常組織之間雖然可見到腫瘤細胞浸潤，但可以看到一個較明顯的邊界，在瘤組織內可見壞死區及液化空腔(圖2)，Wistar大鼠組組腫瘤組織與正常組織之間可見到明顯的腫瘤細胞浸潤，邊界不清，瘤組織內可見腫瘤血管和血竇形成(圖3)。

2.3 GFAP免疫組織化學、Wistar大鼠腦膠質瘤模

SD大鼠、Wistar大鼠腦膠質瘤模型的瘤組織內均可見散在的GFAP陽性細胞(圖4，圖5)。表明腫瘤為膠質細胞來源。

2.4 核磁共振影像學檢查

核磁共振觀察證實，SD大鼠、Wistar大鼠腦內接種C6腦膠質瘤細胞的成功率為100%。且SD大鼠、Wistar大鼠均未見轉移(圖6，圖7)。SD大鼠組的個別動物的腫瘤出現體積顯著減小，有自愈傾向。Wistar大鼠的腫瘤未出現體積減小的現象。

3 討論

建立可靠的動物模型是進行各種實驗研究的基礎，大鼠C6腦膠質瘤同種移植瘤動物模型是腦膠質瘤實驗研究中應用最為廣泛的模型之一［4］。C6細胞是經過N-亞硝基甲脲(N-nitosomethylurea)誘發的Wistar大鼠腦膠質瘤細胞系。該細胞經體外和體內傳代培養，生長穩定并具有 GFAP和 S-100蛋白等膠質瘤特異性標志。大鼠腦內接種后腫瘤形成較快，種植腫瘤成活率較高，大鼠體內膠質瘤生長特點與人較為接近，所以廣泛應用于腦膠質瘤治療的實驗研究［5］。本實驗中利用C6腦膠質瘤建立的SD大鼠、Wistar大鼠腦膠質瘤動物模型的成功率均為100%。有研究報道 C6腦膠質瘤動物模型接種懸液的細胞數量影響模型的成功率［6］。本實驗在細胞接種方面主要由以下幾個方面的改進:1)接種細胞數:本實驗接種 C6細胞的密度為2.5×107/mL，細胞總量控制在(2.5～3)×105個細胞/只之間，接種細胞懸液體積控制在10 μL，與國內外報道接種細胞數量在 105～107之間的一致［7，8］。2)消化細胞:為盡量避免細胞受損，在細胞處理方面本實驗也稍有改進。將細胞消化后用Hanks液洗滌2次，再以Hanks液制成細胞懸液，改為將細胞消化后，先用含10%血清的 DMEM液終止消化，再用不含血清DMEM液洗滌，最后以DMEM液制成細胞懸液，離心時間也由8 min縮短至4 min，從而盡量減少洗滌細胞、離心等處理細胞的時間，使細胞處于良好的狀態，保證接種成功率。接種前充分混勻細胞懸液，避免堆積，保證均勻的單細胞懸液。3)進針深度:硬膜下進針3 mm，退1 mm。這樣在靶點處留一空隙，既防止細胞溢出，使細胞充分沉積，又延長了腫瘤細胞與靶組織的接觸時間，從而提高成瘤率。4)建立大批量動物模型時C6細胞的代次與模型一致性的關系:本課題組在長期、大量建立大鼠腦膠質瘤動物模型實驗中，首先保證每次接種的所有細胞均為同一凍存批次;其次，細胞復蘇后均傳代2次，第二次傳代時，接種細胞數要有一定的梯度，從而保證連續2～3 d接種時均能有滿足要求的細胞;細胞接種前24 h換培養液;接種細胞時，各個環節要配合好，盡量縮短動物麻醉、接種部位定位的時間，每消化一次細胞接種2～3只動物;另外，處理細胞條件保持一致，包括培養液、血清、緩沖液、消化液，以及洗滌細胞時間、離心時間等。滿足以上要求，我們就能建立均勻一致的腦膠質瘤動物模型。我們根據上述方法建立的腦膠質瘤動物模型腫瘤成瘤率高，SD大鼠組、Wistar大鼠組成瘤率均為100%;腫瘤細胞生長穩定，腫瘤細胞具有分化程度低，微血管豐富，生長迅速，與人膠質瘤的生長特性相似，可作為基礎、臨床腦膠質瘤病因學、藥效學研究的動物模型。

本實驗結果顯示，SD大鼠組、Wistar大鼠組在腦膠質瘤腫瘤組織內膠質瘤細胞GFAP反應呈弱陽性，周圍膠質瘤細胞呈強陽性，且細胞數明顯多于遠離腫瘤的組織，與相關報道相一致［9］。GFAP與膠質細胞的分化程度有關，由于膠質瘤細胞分化比較幼稚，所以腫瘤內細胞GFAP呈弱陽性，腫瘤周圍膠質細胞數量較多且呈強陽性，可能與膠質瘤刺激周圍腦組織引起的膠質細胞增生有關。

本實驗中發現，SD大鼠組有包膜，邊界清楚，與文獻報道一致［10］。SD大鼠組的個別動物的腫瘤出現體積減小，接種細胞2周后體重呈上升趨勢，提示SD大鼠的C6膠質瘤可能因自身免疫活性較高而有自愈傾向［11］，出現自然消亡。此結果表明，SD大鼠的腦膠質瘤動物模型不適合用于腦膠質瘤的病因學、藥效學、血腦屏障等相關研究;而Wistar大鼠腫瘤細胞浸潤明顯，與周圍正常腦組織邊界不清，腫瘤體積呈進行性增長，這些特性與人惡行腦膠質瘤類似，因此在做此類相關研究時應選用Wistar大鼠制備腦膠質瘤動物模型。

［1］ 郭敏，關麗明，戚喜勛.大鼠C6腦膠質瘤模型建立及X刀治療的護理［J］.中國比較醫學雜志，2007，17(2):123－124.

［2］ Samuel V，Emmanuel L，Barbier，et al.In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma［J］.Neuroimage，2008，40(2):973－983.

［3］ Doblas S，Saunders D， KshirsagarP， etal. Phenyl-tertbutylnitrone induces tumor regression and decreases angiogenesis in a C6 rat glioma model［J］.Free Radic Biol Med，2008，44 (1):63－72.

［4］ 王煜，牛洪泉，董芳永，等.大鼠樹突狀細胞疫苗治療腦膠質瘤的實驗研究［J］.中國神經外科疾病雜志，2005，10:115－117.

［5］ 林健，王偉民，徐如祥.C6大鼠膠質瘤模型及其在腦膠質瘤治療研究中應用的缺陷［J］.中華神經醫學雜志，2003;2(2): 154－156.

［6］ 高大寬，章翔，吳景文，等.建立大鼠 C6腦膠質瘤模型的有效方法［J］.中華實驗外科雜志，2000，17(1):93.

［7］ 李維方，張光霖，朱誠，等.VEGF反義寡核苷酸抑制荷瘤大鼠膠質瘤血管生成的作用和效果［J］.解放軍醫學雜志，2003，28(2):144－145.

［8］ Watanabe K，Sakamoto M，Somiya M，et al.Feasibility and limitation of the rat model by C6 gliomas implanted at the subcutaneous region［J］.Neurol Res，2002，24(5):485－490.

［9］ Sasaki T，YamazakiK， YamoriT， etal. Inhibition of proliferation and induction of differentiation of glioma cells with Datura stramonium agglutinin［J］.Br J Cancer，2002，87(8): 918－923.

［10］ Farrell CL，Stewart PA，Del Maestro RF.A new glioma model in rat:the C6 spheroid implantation technique permeability and vascular characterization［J］.J Neurooncol，1987，4(4):403－415.

［11］ Vince GH，Bendszus M，Schweitzer T，et al.Spontaneous regression of experimental gliomas:an immunohistochemical and MRI study of the C6 glioma spheroid implantation model［J］. Exp Neurol，2004，190(2):478－485.

Establishment and Comparison of Sprague-Dawley Rats and Wistar Rats of Cerebral Glioma Model

WANG Xiao-wu1，LI Kang-chu1，DING Gui-rong1，XU Sheng-long1，ZHOU Yong-chun1，TAN Juan1，CHANG Ying-juan2，GUO Guo-zhen1
(1.Department of Radiation Medicine，Faculty of Preventive Medicine，Xi'an 710032，China; 2.Department of Radiology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710031，China)

ObjectiveTo establish C6(2.5×105cell/rat)glioma model in two different strains rats(Sprague-Dawley rats and Wistar rats)and to compare the growth patterns of intracranial tumors in order to provide a suitable proexperimental model system for the study of neoplastic gliomas。MethodsThe rats were placed on a stereotactic head holder and C6 cells of glioma were stereotaxically implanted into the right cerebral cortext region of Sprague-Dawley(SD) rats and Wistar rats.After C6 cells inoculation，we observed the living state of rats，tumor volumes，tumor histopathology and the expression of GFAP in tumors by pathology，immunohistochemistry and magnetic resonance imaging(MRI). Results The formation rate of brain tumor was 100%in SD rats and Wistar rats，none of them had distant metastasis. However，the tumor formation time of SD rats was longer than that of Wistar rats and some SD rats with intracranial tumorshad the tendency of spontaneous cure。ConclusionThe Wistar rat C6 glioma resembles human glioma in histopathological and morphological features，therefore，it can be used as an ideal model for studying huaman glioma's pathogenesy and therapeutic strategy.Because the brain tumors formed in SD rats is more like metastatic tumors，and these tumors had the tendency of spontaneous cure，it is not suitable as an experimental model for human glioma.

Glioma;Model，animal;Sprague-Dawley rats;Wistar rats

R-739.41

A

1671-7856(2010)05-0008-04

2009-12-15

國家自然科學基金(No.60871068)和全國優秀博士學位論文作者專項基金(No.200465)。

王曉武(1972－)，女，博士，高級實驗師。E-mail:xiaowu0330@yahoo.con.cn

郭國禎，男，教授，博士導師，研究方向:電磁輻射生物學。E-mail:guozhen@fmmu.edu.cn

丁桂榮，女，教授，碩士導師，研究方向:電磁輻射生物學。E-mail:dingzhao@fmmu.edu.cn