肥胖大鼠瘦素信號傳導(dǎo)通路的變化

蘇 衛(wèi)，馬曉紅，張文明，劉紅霞，張連峰

(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，北京 100021)

研究報告

肥胖大鼠瘦素信號傳導(dǎo)通路的變化

蘇 衛(wèi)，馬曉紅，張文明，劉紅霞，張連峰

(中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所，北京 100021)

目的篩選與人類代謝障礙性肥胖癥發(fā)病病因?qū)W相似的肥胖大鼠模型，并對肥胖個體Leptin信號傳導(dǎo)通路的改變情況進行初步研究。方法離乳雄性Wistar大鼠以高脂飼料喂養(yǎng)6周后，取體重增加值大的前1/4部分作為肥胖傾向組大鼠。對肥胖傾向組大鼠，繼續(xù)進行高脂飼料喂養(yǎng)，并觀察其體重、血清 Leptin的變化趨勢;試驗49周后，大鼠處死，對內(nèi)臟脂肪含量、附睪脂肪細(xì)胞大小以及下丘腦 LRb(Leptin受體 b亞型)表達(dá)水平及Stat3磷酸化水平(Tyr705磷酸化)進行測定。結(jié)果正常對照組大鼠和肥胖傾向組大鼠在不同飼料喂養(yǎng)的第17周開始體重相對增加值出現(xiàn)組間顯著性差異;除第16周肥胖傾向組大鼠的血清 Leptin濃度高于正常對照組，但不存在顯著性差異之外，其它采血時間點，肥胖傾向組的血清 Leptin濃度均顯著高于正常對照組;動物處死后，肥胖傾向組大鼠的內(nèi)臟脂肪含量和附睪脂肪細(xì)胞大小均顯著大于正常對照組;兩組大鼠在下丘腦LRb表達(dá)水平和細(xì)胞漿內(nèi)Stat3磷酸化水平方面不存在顯著性差異。結(jié)論本研究得到了與營養(yǎng)性肥胖人群臨床表現(xiàn)相似的肥胖大鼠;同時發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠在長期高濃度Leptin刺激后，可能引起了中樞性 Leptin抵抗，致使 Leptin對體重調(diào)節(jié)的正常生理作用受到抑制，脂代謝異常的程度進一步加深，最終表現(xiàn)為脂肪細(xì)胞體積增大、內(nèi)臟脂肪含量升高和體重增加。

肥胖大鼠;高脂飲食;廋素;信號傳導(dǎo)通道

肥胖是遺傳因素、環(huán)境因素和心理因素共同作用所導(dǎo)致的代謝障礙性疾病，肥胖癥的發(fā)生，不僅對機體自身產(chǎn)生直接影響，也是諸多代謝性疾病的主要誘因［1］。

本研究選用具有遺傳多態(tài)性的封閉群 Wistar大鼠［2］，以高脂飼料作為大鼠能量攝入來源，通過長期的喂養(yǎng)、篩選后，希望能夠得到與人類營養(yǎng)性肥胖癥病因相近，臨床表現(xiàn)相似的肥胖大鼠模型。而瘦素(Leptin)，主要通過白色脂肪細(xì)胞分泌，是食物攝入和能量消耗的重要傳入型信號分子，通過作用于中樞神經(jīng)下丘腦中特定神經(jīng)元上的瘦素受體(Ob－Rb)激活下游不同的信號通路進行食物攝入和能量消耗的調(diào)節(jié)［3］。其中在下丘腦核團高度表達(dá)的主要功能受體b型(LRb)，為長跨膜受體，屬于細(xì)胞因子 I受體超家族，該受體激活后，通過 JAKSTAT(Jak激酶－信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子)途徑進行生物信息的傳遞，從而對食物攝入和能量消耗進行調(diào)控。故本研究將血清Leptin、下丘腦LRb、Stat3和Tyr705磷酸化的 Stat3作為考察的主要指標(biāo)，力求在Leptin信息傳導(dǎo)通路方面對肥胖發(fā)生的病理學(xué)機制進行探索性研究。

1 材料和方法

1.1 實驗對象

離乳雄性Wistar大鼠(SPF)，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所資源中心提供［SCXK(京)2000－0006］。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑:Leptin測定用試劑盒(Assay Designs，900－015);Stat3抗體(兔抗鼠 Stat3，Cell Signaling Technology，#9132);Phospho－Stat3抗體(兔抗 鼠 Phospho－Stat3，CellSignaling Technology，# 9131S)，LRb抗體(兔抗鼠 LRb，Alpha Diagnostic International，OBR13－A);化學(xué)發(fā)光底物 (Pierce Biotechnology，34077)。

1.2.2 主要儀器:粗纖維測定儀(M6型，Tecato);高溫爐(KM－100型，ASH);索氏脂肪提取裝置;全自動酶標(biāo)儀(Stat fax2100型，Awareness Technology Inc);高速冷凍離心機(CS－15R型，Bcekman);Nikon顯微鏡;垂直式電泳儀(AE－6450型，ATTO Co.日本);半干式電轉(zhuǎn)移裝置(AE－6675型，ATTO Co.日本);凝膠圖像成像分析儀(GAS7001B型，UVI，英國);成像軟件:UVIPhoto;分析軟件:UVISoft UVIBand Application V97.04。

1.3 實驗用飼料

特定能量值的維持飼料和高脂飼料由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所資源中心提供［SCXK(京) 2001－0003］。

對飼料中碳水化合物、粗脂肪、粗蛋白均采用化學(xué)法進行含量測定，具體的操作步驟見GB14924.9－2001。

飼料中各營養(yǎng)素提供能量的計算標(biāo)準(zhǔn)為［4］:炭水化合物提供能量為16.75 kJ/g;蛋白提供能量為16.75 kJ/g;粗脂肪提供能量為37.68 kJ/g，其余成分不提供能量。

1.4 方法

1.4.1 動物分組:離乳雄性 Wistar大鼠進入動物房，適應(yīng)環(huán)境3 d，稱重(W0)后隨機分組，9只/組。在保證動物有充足的食物和飲水的前提下，取其中任一組作為正常對照組，給予維持飼料;其余為高脂飲食組，給予高脂飼料(室溫22℃ ±3℃，相對濕度30%～73%，12 h晝夜光照)。正常對照組大鼠和高脂飲食組大鼠分別喂養(yǎng)6周后，稱重(W1)。正常對照組動物保持不變，將高脂飲食組各大鼠按照體重增加值(W1－W0)的大小進行排隊，取體重增加值大的前1/4部分(即體重增加顯著的9只大鼠)作為肥胖傾向組;其余高脂飲食組大鼠棄去［5］。

1.4.2 觀察指標(biāo):體重、血清Leptin水平:實驗過程中每周測定體重一次;Leptin的測定用雙夾心ELISA法。

1.4.3 組織收集和樣本處理:大鼠乙醚麻醉后股動脈取血，離心，收集血清;為進行Western Blot分析，將大鼠處死后，分離下丘腦，稱重，置于0.3 mL蛋白裂解液中(10 mmol/L Tris－HCl，pH6.8;2%SDS;0.08 μg/mL okadaic acid。蛋白酶抑制劑，1 mmol/L PMSF，0.1 mmol/L Benzamidine，和 2 μmol/L leupetin)，以手動組織研磨器研磨。將勻漿迅速煮沸 2 min后，置冰上冷卻，14000 r/min，4℃ 離心15 min。取上清，Brandford法測定總蛋白濃度后分裝凍存于－70℃。

1.4.4 內(nèi)臟脂肪含量的測定:分別取附睪脂肪墊、腹膜后脂肪墊和腸系膜脂肪墊，稱重，依據(jù)下述公式進行計算:內(nèi)臟脂肪含量%=(附睪脂肪墊重+腹膜后脂肪墊重+腸系膜脂肪墊重)÷體重×100%

1.4.5 附睪脂肪細(xì)胞大小的測定:取附睪脂肪墊，用40 g/L甲醛固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋切片，HE染色。將固定切片處理過的附睪脂肪墊置于400倍顯微鏡下計數(shù)全視野中的脂肪細(xì)胞個數(shù)，用測微尺測量脂肪細(xì)胞的大小。每張切片計數(shù)10個視野的細(xì)胞數(shù)，測量10個細(xì)胞的直徑，取平均值作為每例的數(shù)據(jù)［6］。

1.4.6 LRb分析:取蛋白提取液(160 μg)于SDSPAGE凝膠分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，將膜與特異的抗LRb抗體孵育，通過增強酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法和灰度掃描來定量。

1.4.7 Stat3和 phospho－Stat3分析:取蛋白提取液(60 μg)于SDS－PAGE凝膠分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，將膜與特異的抗Stat3抗體(磷酸化和非磷酸化)和Tyr705磷酸化的Stat3抗體孵育，通過增強酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法和灰度掃描來定量。

2 結(jié)果

2.1 維持飼料和高脂飼料營養(yǎng)素

組別/項目Group/Item 脂肪Fat 蛋白質(zhì)Protein 碳水化合物Carbohydrate維持飼料Control dietary(1298 kJ/100g)質(zhì)量組成(%)Mass components 3.17 17.40 52.99能量組成(%)Energy components 9.20 22.45 68.35高脂飼料High－fat dietary(1628 kJ/100g)質(zhì)量組成(%)Mass components 18.99 14.51 40.00能量組成(%)Energy components 43.95 14.92 41.14

表2 大鼠體重變化Tab.2 Changes of body weight

經(jīng)化學(xué)分析，實驗所使用的維持飼料和高脂飼料中的各種營養(yǎng)素的質(zhì)量組成和能量組成如表1。

2.2 大鼠體重的變化

通過1年對肥胖傾向組與正常對照組大鼠體重的動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)高脂飼料喂養(yǎng)的大鼠在第14周開始，體重絕對增加值較正常對照組出現(xiàn)顯著性的增加，第17周開始體重相對增加值出現(xiàn)顯著性增加，從而表明，本研究所采用的肥胖傾向大鼠篩選方案是可行的(表2)。

2.3 血清Leptin的變化

對血清Leptin進行測定的結(jié)果表明，除第16周肥胖傾向組大鼠的血清 Leptin濃度高于正常對照組，但不存在顯著性差異之外，其它肥胖傾向組的血清Leptin濃度均顯著高于正常對照組(表3)。肥胖傾向組大鼠在Leptin水平長期高于正常對照組大鼠的情況下仍然表現(xiàn)為顯著性的體重增加，這說明，肥胖傾向組大鼠可能發(fā)生了Leptin抵抗。

2.4 脂肪組織與細(xì)胞的變化

正常對照組大鼠和肥胖組大鼠處死后，取附睪脂肪墊進行 HE染色，于400倍鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化(圖1，見彩插2)。通過對正常對照組大鼠和肥胖組大鼠內(nèi)臟脂肪重量、顯微鏡下相同視野內(nèi)脂肪細(xì)胞的記數(shù)進行統(tǒng)計，肥胖大鼠的脂肪細(xì)胞直徑、內(nèi)臟脂肪重量及內(nèi)臟脂肪含量(%)都顯著高于正常對照組(表4)。對所有18只大鼠(包括正常對照組和肥胖組各9只)的內(nèi)臟脂肪重量和Leptin濃度之間的相關(guān)性進行分析(圖2)表明，二者之間呈正的直線相關(guān)關(guān)系，這表明，內(nèi)臟脂肪含量對血清Leptin濃度的增加發(fā)揮了直接作用。

2.5 下丘腦Leptin受體b亞型(LRb)蛋白表達(dá)量及胞內(nèi)Stat3蛋白Tyr705磷酸化水平

用Western Blot測定下丘腦 Leptin受體 b亞型(LRb)蛋白表達(dá)量(圖3A)和胞內(nèi)Stat3蛋白Tyr705磷酸化水平(圖3B)，結(jié)果均未出現(xiàn)顯著性差異。

表3 血清Leptin的測定結(jié)果Tab.3 Changes of serum Leptin concentration

表4 大鼠脂肪組織、細(xì)胞指標(biāo)Tab.4 Changes of rats adipose tissue and adipocytes

3 討論

肥胖，不僅僅是體重增加，血脂異常。隨著包括高血壓、糖尿病和心臟病等代謝性疾病與肥胖密切關(guān)聯(lián)的不斷明晰，對肥胖，特別是代謝障礙性肥胖的研究已提升到一個新的高度。肥胖的形成，與生活行為方式、攝食行為、嗜好、胰島素反應(yīng)以及社會心理因素相互作用有著密切的關(guān)系，而多基因的遺傳因素則是其致病的本質(zhì)因素。在對基因剔除小鼠的研究中就發(fā)現(xiàn)，有超過6000個基因可能影響小鼠的體重［7］。眾多的基因，在環(huán)境因素，特別是食物營養(yǎng)結(jié)構(gòu)和能量供給發(fā)生極大變化(高糖、高脂肪飲食)的情況下，使機體正常的食物神經(jīng)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)［8］，脂肪因子調(diào)節(jié)［9］和能量平衡系統(tǒng)［10］的相互調(diào)節(jié)作用發(fā)生紊亂，致使機體能量平衡失調(diào)，從而導(dǎo)致肥胖。

圖2 內(nèi)臟脂肪重量與血清Leptin濃度間的相關(guān)性分析Fig.2 Correlativity between weight of visceral fat and concentration of serum Leptin

圖3 高脂飲食對LRb蛋白表達(dá)量和Stat3蛋白Tyr705磷酸化水平的影響Fig.3 Effect of the high－fat diet on protein expression of Leptin receptor b(LRb)and phosphorylation extent of Stat3 at the location of tyr705

本研究利用封閉群 Wistar大鼠的遺傳多態(tài)性，篩選出具有肥胖傾向的大鼠，并以此為實驗對象，結(jié)合長期給與高脂飼料喂養(yǎng)，可使攜帶肥胖傾向基因的動物最終發(fā)展為與人類代謝障礙性肥胖癥病因相近，臨床表現(xiàn)相似的肥胖大鼠模型。其中，肥胖組大鼠與正常對照組比較，脂肪細(xì)胞體積顯著增大;內(nèi)臟脂肪重和體脂含量也顯著高于正常對照組大鼠。證明，具有肥胖傾向的大鼠經(jīng)長期高脂飼料喂養(yǎng)后，會引起大鼠體內(nèi)脂肪細(xì)胞不斷增大，細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成增加［11］，從而導(dǎo)致脂肪進行性堆積，體重持續(xù)性增加。

而瘦素(Leptin)，這種主要由白色脂肪分泌的肽類物質(zhì)，其受體激活后，通過JAK－STAT途徑來進行生物信息的傳遞，從而對食物的攝入及能量的消耗做出調(diào)控。Western Blot的結(jié)果表明:盡管肥胖傾向組大鼠血清 Leptin濃度顯著高于正常對照組大鼠，但是兩組大鼠在下丘腦LRb蛋白的表達(dá)水平上以及由Leptin和 LRb特異性結(jié)合后所引起的胞漿內(nèi)Stat3磷酸化水平方面均不存在統(tǒng)計學(xué)差異。這與Shu等［12］對雄性 C57Bl/6J小鼠進行19周高脂喂養(yǎng)研究、Sahu等［13］對雄性Wistar大鼠進行9周高脂喂養(yǎng)研究和 Christian等［14］對雄性 Wistar大鼠進行15周高脂喂養(yǎng)研究后所得到的結(jié)果基本一致。通過對上述實驗結(jié)果進行分析，我們認(rèn)為:大鼠在長期的高脂飼料喂養(yǎng)過程中，隨著血清 Leptin濃度的進行性增加，產(chǎn)生了由持續(xù)性高 Leptin濃度刺激所引起的LRb對Leptin作用的進行性脫敏效應(yīng)，最終導(dǎo)致中樞性 Leptin抵抗。也就是高脂飼料喂養(yǎng)后，大鼠體內(nèi)能量平衡狀態(tài)和脂代謝發(fā)生異常時，Leptin對食欲、能量消耗及交感神經(jīng)活性的正常調(diào)控作用受到抑制，從而出現(xiàn)了，即使大鼠血清Leptin水平持續(xù)增高，仍然表現(xiàn)為進行性的體重增加和體脂含量增加的現(xiàn)象。

此外，將分離得到的脂肪總重量和血清 Leptin水平二者間進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，全脂肪重量和血清Leptin水平間呈正的直線相關(guān)關(guān)系(r=0.7791)，這與文獻(xiàn)報道中“Leptin主要由白色脂肪細(xì)胞分泌的”這一結(jié)論相吻合。

［1］ Labib M.The investigation and management of obesity［J］.Clin Pathol，2003，56:17－25.

［2］ Philip JS，MichaelM，Eugene WS. Impaired leptin signal transduction with age－related obesity［J］.Neuropharmacology，2000，39:1872－1879.

［3］ Scarpace PJ，Matheny M，and Tumer N.Hypothalamic leptin resistance is associated with impaired leptin signal transduction in aged obese rats［J］.Neuroscience，2001，104(4):1111－1117.

［4］ Chinese Academy of Preventive Medicine，INFS.List of food ingredients［S］. Peoples Medical Publishing House，3 (Chinese).

［5］ Sam C，Brent Gr，F(xiàn)atima Y，et al.Metabolic differences between obesity－prone and obesity－resistant rats［J］.Physiol Regul Integr Comp Physiol，1990，259:R1103－R1110.

［6］ Chen Q.Methodology of Chinese materia medica pharmacology study［M］.PeoplesMedicalPublishingHouse，1993，627 (Chinese).

［7］ Danielle RR，Maureen PL，Michael GT.Reduced body weight is a common effect of gene knockout in mice［C］.BMC Genetics，2008，9:4.doi:10.1186/1471－2156－9－4.

［8］ Kalra SP，Dube MG，Pu S. Interacting appetite－regulating pathways in the hypothalamic regulation of body weigh［J］. Endoc Rev，1999，20(1):68－100.

［9］ Yuji M，Iichiro S，Shinji K，et al.Importance of adipocytokines in obesity－related diseases［J］.Horm Res，2003，60:56－59.

［10］ Bruce MS，Jeffrey SF.Obesity and the regulation of energy balance［J］.Cell，2001，104:531–543.

［11］ Petri TK，Esko AN，Tatu AM.Regulation of cholesterol synthesis and storage in fat cells［J］.Lipid Research，1975，16:211－223.

［12］ Shu L，Storlien LH，Huang XF.Leptin receptor，NPY and POMC Mrna expression in the diet induced obese mouse brain［J］. Brain Res，2000，875:89－95.

［13］ Sahu A，Nguyen L，O'Doherty RM.Nutritional regulation of hypothalamic leptin receptor gene expression is defective in dietinduced obesity［J］.Neuroendocrinology，2002，14:887－893.

［14］ Christian P，Gerard PMcG，Rudolf E.Leptin receptor expression and suppressor of cytokine signaling transcript levels in high－fatfed rats［J］.Life Science，2000，67:2971－2981.

Changes of Leptin Signal Pathway in Rat Obesity Progression

SU Wei，MA Xiao－h(huán)ong，ZHANG Wen－ming，LIU Hong－xia，ZHANG Lian－feng
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences＆Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo screen obesity rat model of metabolic disturbance，and to determine whether Leptin signal transduction pathway in obesity rats are changed or not.Method Male Wistar weaning rats were divided randomly into control group and high－fat fed group.Rats of high－fat fed group were fed high－fat diet for 6 weeks，and then，screened them based on body weight gain(upper quarter for obesity－prone rats).During the dietary period，body weight and serum Leptin level of obesity－prone group rats and control group rats were determined on schedule;Rats were decapitated 12 months later，content of body lipid，size of epididymis fat cell and protein expression level of LRb，Stat3 and p－Stat3 in hypothalamus were determined as well.Result Both body weight and relative added body weight had got significant differences between control group and obesity－susceptible group after the 17thweek feeding;serum Leptin level had significant differences between control group and obesity－susceptible group except for the 16thweek;Percent of body lipidsand the size of epididymis fat cell had got significant differences between control group and obesity－susceptible group after the special diet feeding for 49 weeks;LRb protein expression level and Stat3 phosphorylation level in hypothalamus had no differences between obesity－susceptible group and control group。ConclusionOur study got the first generation of obesity rat model which had the similarly pathogenesis and clinical symptoms successfully.The down－regulation of LRb must be a key factor charged for the disregulation of lipid metabolism.

Obesity rat;High－fat feed;Leptin;Signal pathway

Q495

A

1671－7856(2010)05－0015－06

2009－10－15

衛(wèi)生部行業(yè)基金，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501－026)。

蘇衛(wèi)(1962－)，女，副研究員，研究方向:代謝性疾病比較醫(yī)學(xué)。

張連峰。E－mail:Zhanglf@cnilas.org