膠原/纖維蛋白止血效果觀察

趙士海，胡慶柳，鐘志勇，饒子亮，王 剛，陳系古

(1.廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248;2.深圳市清華大學研究院，深圳 518057)

膠原/纖維蛋白止血效果觀察

趙士海1，胡慶柳2，鐘志勇1，饒子亮1，王 剛1，陳系古1

(1.廣東省醫學實驗動物中心，佛山 528248;2.深圳市清華大學研究院，深圳 518057)

目的 研究膠原/纖維蛋白對新西蘭兔的止血作用，并與膠原蛋白海綿止血效果作比較。方法 選用膠原/纖維蛋白止血貼，對新西蘭兔耳部動、靜脈出血、耳表創面、股動脈割傷、肝損傷、體表創面進行止血試驗，同時與膠原蛋白海綿止血效果作比較，觀察其止血時間、失血量、敷料與創面的粘合等情況，并定期觀察創面愈合、體內吸收和抗炎情況。結果 膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組新西蘭兔耳動、靜脈、耳表創面、股動脈割傷、標準肝創傷的止血時間與對照組比較，差異顯著(P<0.05)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組新西蘭兔耳動、靜脈、耳表創面的止血時間與膠原蛋白海綿組，差異顯著(P<0.05)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組動物的耳表創面、標準肝創傷失血量與對照組比較，差異顯著(P<0.05)。體內標準肝創傷、體表創傷后期觀察，膠原/纖維蛋白復合止血貼與膠原蛋白海綿均能在21d內完全吸收，未見炎癥反應。結論 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳動脈割傷、耳靜脈割傷、耳標創傷、股動脈割傷和標準肝損傷模型都具有明顯的止血作用，體表創面傷口恢復良好，體內吸收速度快，具有一定的抗炎作用，而且在新西蘭兔耳動脈、耳靜脈割傷和耳表創傷的止血效果明顯優于膠原蛋白海綿。膠原/纖維蛋白復合止血貼是一種較安全有效的局部止血生物材料。

膠原/纖維蛋白;止血;新西蘭兔

隨著生物醫學工程的不斷發展，生物醫用材料日益受到人們的關注。膠原蛋白作為一種天然生物材料，因其具有低抗原性、生物可降解性、優越的生物相容性并且還有利于細胞貼附和遷移等特點，被廣泛應用于生物醫用材料領域。膠原/纖維蛋白復合止血貼是一種以豬、牛或馬腿肌腱為原料生產的膠原海綿，再在其表面涂敷纖維蛋白原和凝血酶而制成的可用于內臟及體表創傷止血的可吸收醫用敷料。本實驗應用膠原/纖維蛋白復合制備的止血材料，通過對新西蘭兔失血模型作用效果的研究，來解決目前止血材料存在的止血效果不理想、降解慢、抗炎作用不明顯等問題。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

新西蘭兔，普通級，體重1.5 ～2.5 kg，由廣東省醫學實驗動物中心提供［SCXK(粵)2003-0002，合格證號:2007A006］。

1.2 主要試劑和儀器

膠原/纖維蛋白復合止血貼，由深圳市清華大學研究院提供，批號:20080105。膠原蛋白海綿，上海其勝生物制劑有限公司生產，批號071072。麻醉藥:速眠新，解放軍農牧獸醫研究所產品，批號:20071109。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳部靜脈出血的止血性能研究:新西蘭兔，15只，隨機分為對照組，膠原蛋白海綿組，膠原/纖維蛋白復合止血貼組，每組5只。麻醉，在右耳耳緣靜脈周圍去毛，輕彈幾下。距耳尖部8 cm處割斷耳緣靜脈，5 s后將相應受試物敷于傷口，對照組壓敷消毒海綿;膠原蛋白海綿組壓敷膠原蛋白海綿;膠原/纖維蛋白復合止血貼組壓敷膠原/纖維蛋白復合止血貼。每隔30 s觀察傷口的流血情況，記錄止血時間。止血時間(s):記錄從切斷靜脈至不再出血的時間。

1.3.2 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳部動脈血管割傷的止血性能研究:新西蘭兔，15只，隨機分為對照組，膠原蛋白海綿組，膠原/纖維蛋白復合止血貼組，每組5只。麻醉，在左耳耳緣動脈周圍去毛，輕彈幾下。距耳尖部8 cm處割斷耳緣動脈，5 s后將相應受試物敷于傷口，空白對照組壓敷消毒海綿;膠原蛋白海綿組壓敷膠原蛋白海綿;膠原/纖維蛋白復合止血貼組壓敷膠原/纖維蛋白復合止血貼。每隔30 s觀察傷口的流血情況，記錄止血時間。

1.3.3 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳表創面的止血性能研究:新西蘭兔，20只，隨機分為2組，每組10只。1組新西蘭兔左耳用膠原/纖維蛋白復合止血貼，右耳用無菌藥棉進行常規治療，另1組新西蘭兔左耳使用膠原蛋白海綿進行治療。無菌條件下于新西蘭兔左右耳緣末1/3處，用消毒后的剪刀橫剪一約1 cm長的傷口，傷口從耳緣橫切新西蘭兔耳朵，左右受到同樣剪傷。于5 s后將相應受試物敷于傷口，用手按壓，每隔20 s觀察損傷部位的止血情況，并用藥棉吸附所出血液，以不再滲血、出血為止血時間，并計算失血量。失血量 =止血后藥棉和受試物的重量-操作前精確稱量的藥棉和受試物重量。

1.3.4 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔股動脈割傷的治療研究:新西蘭兔，15只，隨機分為對照組，膠原蛋白海綿組，膠原/纖維蛋白復合止血貼組，每組5只。麻醉后，固定在實驗臺。無菌條件下鈍性分離股動脈，將股動脈切開3/4，自由噴血5 s鐘。對照組用無菌紗布止血;膠原蛋白海綿組采用膠原蛋白海綿止血;膠原/纖維蛋白復合止血貼組使用膠原/纖維蛋白復合止血貼進行止血。加壓壓力2 kg，每隔30 s觀察一次，直至不出血為止，記錄止血時間。

1.3.5 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔標準肝創傷模型的治療研究:新西蘭兔，30只，隨機分為對照組，膠原蛋白海綿組，膠原/纖維蛋白復合止血貼組，每組10只。麻醉后，固定在實驗臺，在無菌條件下開腹，暴露肝臟，并在肝表面切除約1 cm ×1 cm的肝組織，造成出血創面。對照組給予消毒海綿止血，膠原蛋白海綿組給予膠原蛋白海綿，膠原/纖維蛋白復合止血貼組給予膠原/纖維蛋白復合止血貼，敷壓傷口，觀察止血情況，記錄止血時間，測量出血量。術后縫合傷口，動物單籠飼養，自由飲水進食，觀察新西蘭兔存活情況。于術后第2天、第7天各組取2只新西蘭兔，術后第14天和第21天各取3只新西蘭兔，剖腹觀察腹腔內粘連、腹腔內感染及肝臟愈合情況。

1.3.6 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔體表創面的止血抗炎性能研究:新西蘭兔，15只，隨機分為對照組，膠原蛋白海綿組，膠原/纖維蛋白復合止血貼組，每組5只。麻醉后在脊柱兩側剪毛，面積約6 cm ×10 cm。無菌條件下使用7#注射器針頭在脫毛區皮膚“#”型劃傷(以滲血而無明顯出血為度)，對照組動物敷無菌藥棉，膠原蛋白海綿組動物敷膠原蛋白海綿，膠原/纖維蛋白復合止血貼組敷膠原/纖維蛋白復合止血貼。使用紗布繃帶腹部纏繞固定。12 h后去掉外敷物，記錄創面情況，用生理鹽水清洗，更換外敷物，每日1次，連續3 d。3 d后去掉外敷受試物，使創面自然恢復，每日觀察記錄創面情況，連續12 d，每天觀察動物整理情況及受損區的紅腫、結痂、脫痂等情況。

2 結果

2.1 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳部動、靜脈出血的止血性能研究

實驗結果表明，膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組新西蘭兔耳動脈的止血時間與對照組比較，差異顯著(P<0.05)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組新西蘭兔耳動脈的止血時間與膠原蛋白海綿組，差異顯著(P<0.05)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組新西蘭兔耳靜脈的止血時間與對照組比較，差異極顯著(P<0.01)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組新西蘭兔耳靜脈的止血時間與膠原蛋白海綿組，差異極顯著(P<0.01)(表 1)。

表1 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳部動、靜脈止血時間的影響Tab.1 The effect of hemostasis time of composite collagen and fibrin hemostatic paste for ear artery and ear vein of New Zealand rabbit

2.2 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳表創面的止血性能研究

實驗結果表明，在耳表創面的止血時間方面，膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組動物的止血時間與對照組比較，差異顯著(P<0.05)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組動物的止血時間與膠原蛋白海綿組比較，差異顯著(P<0.05)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組動物的失血量與對照組比較，差異顯著(P<0.05)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組動物的失血量與膠原蛋白海綿組比較，差異不顯著(P<0.05)(表 2)。

2.3 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔股動脈割傷止血時間的影響

實驗結果表明，在新西蘭兔股動脈割傷的止血時間方面，膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組動物的止血時間與對照組比較，差異極顯著(P<0.01)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組動物的止血時間與膠原蛋白海綿組比較，無顯著性差異(P>0.05)(表 3)。

表2 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳表創面止血效果的影響Tab.2 The effect of the wound surface of ear of composite collagen and fibrin hemostatic paste in New Zealand rabbit

表3 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔股動脈割傷的止血效果的影響Tab.3 The effect of the wound of ear artery of composite collagen and fibrin hemostatic paste in New Zealand rabbit

2.4 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔標準肝創傷模型的治療研究

實驗結果表明，在新西蘭兔標準肝創傷模型的研究中，膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組動物的止血時間與對照組比較，差異極顯著(P<0.01)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組動物的止血時間與膠原蛋白海綿組比較，無顯著型差異(P>0.05)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組、膠原蛋白海綿組動物的失血量與對照組比較，差異極顯著(P<0.01)。膠原/纖維蛋白復合止血貼組動物的失血量與膠原蛋白海綿組比較，無顯著型差異(P>0.05)(表 4)。

表4 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔標準肝創傷模型的止血效果的影響Tab.4 The effect of the injury of liver of composite collagen and fibrin hemostatic paste in New Zealand rabbit

對新西蘭兔標準肝創傷模型術后解剖觀察結果如下:2 d:膠原/纖維蛋白復合止血貼和膠原蛋白海綿與創面粘附良好，周圍被大網膜包裹，止血貼形成膠狀物質附著在創口上，未見出血，膠原蛋白海綿組創傷肝臟可見一定程度腫大;7 d:兩種止血貼均與創傷口粘附良好，海綿與凝血塊在創面上形成一完整覆蓋物，傷口周圍有一層白色薄膜，傷口恢復良好;14 d:兩種止血貼均已經被基本吸收，未見粘連，與血凝塊在創面上形成一層完整的覆蓋物，傷口周圍覆蓋一層白色的薄膜，創口恢復良好，未見肝臟腫大;21 d:兩止血貼組創口恢復良好，未見粘連，止血貼被完全吸收，創口處可見一層薄薄的白色組織，肝臟未見異常。

綜合以上觀察結果，膠原/纖維蛋白復合止血貼和膠原蛋白海綿同樣具有良好的親水性，止血速度快，與創面具有較強的粘附力，用于肝臟止血后。局部無異常刺激反應，體內吸收速度快。

2.5 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔體表創面的恢復研究

通過12 d的觀察，各組動物已基本脫痂痊愈，膠原蛋白海綿組和膠原/纖維蛋白復合止血貼動物的創面觀察以及愈合情況，與對照組比較無明顯差異。對照組有3只受試新西蘭兔的傷口于第3天開始出現輕微紅腫，第5天紅腫開始消退。膠原蛋白海綿組和膠原/纖維蛋白復合止血貼動物的創面未 見異常情況(表5)。

表5 膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔體表創面的恢復研究Tab.5 The recuperate study of body raw surface of composite collagen and fibrin hemostatic paste in New Zealand rabbit

3 討論

膠原止血海綿作為醫用生物材料，具有安全可靠性［1、2］。本試驗涉及一種以豬、牛或馬腿肌腱為原料生產的膠原海綿，再在其表面涂敷纖維蛋白原和凝血酶而制成的可用于內臟及體表創傷止血的可吸收醫用敷料-膠原/纖維蛋白復合止血貼。用一般纖維蛋白膠時，先要把纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液混合，再把混合液敷在傷口上，利用生化止血反應，僅能止住細小靜脈和毛細血管的出血;膠原/纖維蛋白復合止血貼上已經附有纖維蛋白原和凝血酶，可以即時敷在傷口上，纖維蛋白原和凝血酶與血、淋巴液或生理鹽水接觸后便會溶解，凝血反應即開始(生化止血)，同時膠原海綿立即變成薄而致密的敷料緊緊粘附在傷口或器官的表面(機械止血)，同時具有生化止血和機械止血的功能，從而提高止血效果。

由實驗數據可知，膠原/纖維蛋白復合止血貼對新西蘭兔耳動脈割傷、耳靜脈割傷、耳標創傷、股動脈割傷和標準肝損傷模型都具有明顯的止血作用，而且在新西蘭兔耳動脈、耳靜脈割傷和耳表創傷的止血效果明顯優于膠原蛋白海綿。從實驗過程中看出，肝臟表淺切口外用膠原/纖維蛋白復合止血貼和膠原蛋白海綿兩種止血材料，均能即刻止血，出血量少，兩種材料均能與創面形成較為牢固的粘附，促進凝血過程［3－6］。在后期觀察中發現，用膠原/纖維蛋白復合止血貼處理的體表創面傷口恢復良好，體內吸收速度快，術后14 d已有大部分降解，術后21 d基本完全降解吸收，且局部無異常刺激，未見炎癥反應，這與膠原的抗原性低，細胞親和力高，引起局部刺激反應小有關［7］。此外，膠原/纖維蛋白復合止血貼與創面接觸時，除吸附血小板促進凝血外，還可激活和誘導各種生長因子［8］，加速細胞吞噬作用，通過巨噬細胞和粒細胞的吞噬作用，祛除降解碎片［7］。而且，膠原/纖維蛋白復合止血貼克服了單純膠原蛋白海綿的力學能力差，急促的出血會沖破膠原體本身和溶解速度太快，影響止血效果和使用的安全性等缺點［9］。

膠原/纖維蛋白復合止血貼與機體生物相容性好，在體內可徹底降解;生化止血和機械止血相結合，大大提高了止血效能，不但能止住毛細血管的滲血，還能止住小動脈、靜脈的出血，大大拓展了臨床應用范圍，可用于內臟手術止血和較大的體表創傷止血，其在體內的降解速度可通過加入某種酶的量調控，最快可在半個月內徹底降解。更符合臨床應用的實際要求。

［1］Ciapetti G，Verri E，Granehi D，et al.In vitro assessment of phagocytosis of bovine collagen by human monocytes/maerophages using a spectrophotometric method ［J］.Biomaterials，1996，17(17):1703 － 1707.

［2］Malette WG，Quisleg HJ，Gaines RD，et al.Chitosan:a new hemostatie［J］.Ann Thouae Surg，1983，36(1):55 － 58.

［3］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京:人民衛生出版社，1994:480－521.

［4］鄧曉惠，付建武.家兔手術中三氯化鐵的止血效果［J］.上海實驗動物科學，1997，17(1):31 －33.

［5］肖杭，楊永年.吸收性明膠海綿和止血綾在家兔肌肉、血管及腦組織中吸收性觀察［J］.中國生化藥物雜志，1997，18(4):200–201.

［6］魏領地.五黃膏對家兔動物皮膚炎癥模型的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，1995，6(1):40 －43.

［7］伍衡，冼華壽，張建龍，等.纖維蛋白原－膠原海綿片在肝手術創面的止血及組織封閉作用的動物實驗研究［J］.嶺南現代臨床外科，2 0 0 5，5(1):66－68.

［8］陳玉林.免疫細胞與創面愈合［J］.人民軍醫，2001，44(1):20－21.

［9］梁佩紅，葉春婷，李斯明，等.復合 I型膠原海綿創傷止血的動物實驗研究［J］.創傷外科雜志2002，4(5):274－275.

Observation on the Hemostasis Effect of Collagen/fibrin Composite Hemostasis Paste

ZHAO Shi-hai1，HU Qing-liu2，ZHONG Zhi-yong1，RAO Zi-liang1，WANG Gang1，CHEN Xi-gu1
(1.Guangdong Medical Laboratory Animal Center，Foshan 528248，China;2.Research Institute of Tsinghua University in Shenzhen，Shenzhen 518057，China)

ObjectiveTo study the hemostasis effect of collagen and fibrin combination in New Zealand rabbit，and to compare its effect with collagen sponge.MethodsHemostasis experiments on ear arterial and venous bleeding，wound surface of the ear，incision of the femoral artery，injury of liver and wound surface of body were carried out on New Zealand rabbits.At the same time，its effect of hemostasis was compared with collagen sponge in terms of bleeding time，blood loss and binding of wound and dressings.Also，the healing of wound，its absorption in the body and antiinflammatory effect were regularly observed.ResultsCompared to control group，both collagen/fibrin composite hemostatic(bandage)and collagen sponge had significant differences in hemostasis time of the ear artery and the ear vein，the wound surface of ear，the incision of the femoral artery and the injury of liver(P<0.05).Compared with the collagen sponge group，the composite hemostatic paste group had a significant difference in the hemostasis time of either ear arterial and venous bleeding or the wound surface of ears in New Zealand rabbit(P<0.05).Compared to the control group，the blood loss of the wound surface of ear and the injury of liver，group of collagen and fibrin composite had a significantdifference.It was observed that both collagen/fibrin composite hemostatic collagen paste and collagen sponge could be completely absorbed within 21 days without inflammatory response under the condition of either standard trauma of liver in vivo or superficial trauma.ConclusionThe collagen and fibrin combination hemostatic had a significant hemostasis effect in the ear arterial and venous bleeding，the wound surface of ears，the injury of femoral artery and the injury of liver in New Zealand rabbit.And the superficial wound recovered well.The paste was absorbed fast in the body and had a certain antiinflammatory effect.Furthermore，its hemostatic effect was better than collagen sponge in ear artery and ear vein cut and superficial wound of the ear in New Zealand rabbit.Thus，the collagen and fibrin composite hemostatic paste may be a kind of safe and effective local haemostasis biological material.

Collagen and fibrin;Hemostasis effect;New Zealand rabbit

R331.1

A

1671-7856(2010)05-0061-05

廣東省科技計劃項目(2008A060202002)。

趙士海(1981－)，男，實習研究員，從事實驗動物和比較醫學研究工作。

王剛(1966－)，男，高級獸醫師，從事實驗動物和比較醫學研究工作。E-mail:gdmlac@gmail.com

2009-12-01