D－半乳糖致衰老模型大鼠肝腎功能和自由基代謝與中藥的干預(yù)作用

艾秀峰，陳民利，潘永明，朱科燕，肖 慧，余 佳，謝日青，冷曉霞，陶 濤

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

研究報告

D－半乳糖致衰老模型大鼠肝腎功能和自由基代謝與中藥的干預(yù)作用

艾秀峰，陳民利，潘永明，朱科燕，肖 慧，余 佳，謝日青，冷曉霞，陶 濤

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

目的 觀察D－半乳糖致衰老模型大鼠血糖血脂、肝腎功能和自由基代謝的變化，探討中藥的干預(yù)作用及其抗衰老的機(jī)制。方法大鼠每日皮下注射D－半乳糖，連續(xù)造模7周，建立大鼠衰老模型，造模同時，用抗衰老片和首烏延壽片進(jìn)行干預(yù)，測定試驗(yàn)大鼠的血糖血脂、肝腎功能和 SOD、MDA、Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase等自由基代謝指標(biāo)。結(jié)果造模7周后，模型對照組衰老大鼠 TG、BUN明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，AST、ALP、CREA呈上升趨勢(P＞0.05)，肝、腎組織SOD活性明顯降低(P＜0.05)，腎組織MDA含量明顯升高(P＜0.05)，肝組織Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase活性均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);給予抗衰老片和首烏延壽片后，衰老大鼠TG、AST、BUN、CREA和UA均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，肝、腎組織MDA含量顯著降低(P＜0.05)，SOD活性顯著升高(P＜0.05，P＜0.01)，肝組織 Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性均顯著升高(P＜0.01)。結(jié)論D－半乳糖致衰老大鼠模型的血脂上升、肝腎功能異常和抗脂質(zhì)過氧化的能力下降;給予抗衰老片和首烏延壽片后，可有效改善衰老大鼠的糖脂代謝和肝腎功能，提高肝腎組織的抗脂質(zhì)過氧化的能力，提示中藥的抗衰老作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。

D－半乳糖;衰老大鼠;肝腎功能;自由基;中藥

隨著人類物質(zhì)文明和生活水平的不斷提高，人的壽命普遍延長，人類社會開始步入老齡化。隨著衰老的進(jìn)程，抗病能力減弱，為老年病的發(fā)生奠定了病理基礎(chǔ)。同時老年病的產(chǎn)生和發(fā)展，加速衰老的進(jìn)程，形成惡性循環(huán)，因此衰老與抗衰老成為當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。現(xiàn)代西醫(yī)學(xué)對衰老的發(fā)生發(fā)展還缺乏有效控制手段，而中醫(yī)自古注重延年益壽的養(yǎng)生之道，以整體觀念和辨證論治認(rèn)識疾病的本質(zhì)，通過各種中藥方劑來恢復(fù)被破壞的整體平衡，從而達(dá)到治愈疾病的目的。衰老的生理特征主要表現(xiàn)為肝腎等組織的功能障礙，自由基代謝增多和血糖血脂等的代謝紊亂［1－3］，抗衰老片和首烏延壽片等中藥抗衰老已在臨床上得到廣泛的應(yīng)用［4］，但對藥理實(shí)驗(yàn)研究至今報道甚少，其抗衰老機(jī)理尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用 D－半乳糖誘導(dǎo)衰老大鼠模型［5，6］，觀察其血糖血脂，肝腎功能和自由基代謝的改變，并進(jìn)行抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)，探討中藥抗衰老的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級Wistar大鼠，48只，雌雄各半，體重:雌200～220 g，雄240～260 g，由中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司提供［SCXK(滬) 2007～0005］，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障系統(tǒng)內(nèi)［SYXK(浙)2003～0003］。

1.2 試驗(yàn)藥物及其配制

抗衰老片(浸膏粉):批號080320，臨用前用蒸餾水溶解至濃度30 mg/mL;首烏延壽片:批號為A060801，臨用前用蒸餾水溶解至濃度52.5 mg/mL。

1.3 主要試劑

D－半乳糖，批號:20071115，上海恒信化學(xué)試劑有限公司(原上海試劑二廠);超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)及ATP酶試劑盒，批號: 20080717，南京建成生物工程研究所;尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、尿酸(UA)等測試試劑盒，批號分別為310/ 038/1、171/021/2、10384/46681/5、10385/46621/4、9749/46387/1、250/027/1、10194/46909/1，上海申能－德賽診斷技術(shù)有限公司。

1.4 主要儀器

AF100雪花狀制冰機(jī)，美國SCOTSMAN;Allegra X－15R大容量離心機(jī)，美國貝克曼公司;日立7020全自動生化分析儀，日立公司。

1.5 造模與給藥

用皮下注射 D－半乳糖建立大鼠衰老模型［5，6］，取Wistar大鼠48只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，觀察有無異常情況，然后將大鼠稱重，編號，按體重隨機(jī)分成4組，每組12只，雌雄各半，按3只/籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。除正常對照組外，其余各組每日一次頸背部皮下注射5%D－半乳糖生理鹽水溶液，劑量為100 mg/kg，連續(xù)造模7周。從造模第1天開始給藥，抗衰老片組經(jīng)口灌胃給予 0.30 g/kg劑量的抗衰老片，首烏延壽片組經(jīng)口灌胃給予0.525 g/kg劑量的首烏延壽片，模型對照組和正常對照組每日一次經(jīng)口灌胃給予蒸餾水10 mL/kg，連續(xù)給藥7周。

1.6 生化指標(biāo)測定

1.6.1 血清肝腎功能和血糖血脂測定:動物處死前，先進(jìn)行尾靜脈取血 1 mL，3000 r/min離心 10 min，分離血清，測定AST、ALT、ALP、BUN、CREA、UA等肝腎功能指標(biāo)和血糖(GLU)、血脂(TG、TC)。

1.6.2 肝、腎組織自由基代謝指標(biāo)的測定:分別取部分肝、腎組織，用濾紙吸干水分后稱重，迅速放入盛有碎冰塊的小燒杯中冰浴，按組織重量體積比加預(yù)冷的生理鹽水制備成10%的組織勻漿，3000 r/min離心15 min，然后取組織勻漿上清再用生理鹽水稀釋成所需濃度，－70℃保存，待測。按試劑盒說明書分別測定肝、腎組織SOD活性和MDA含量，測定肝組織中的Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性，測定方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量數(shù)據(jù)均表示為均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)方法采用 One－Way ANOVA分析和Dunnett－t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 D-半乳糖致衰老大鼠的血糖血脂代謝與中藥干預(yù)的影響

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠 TG有明顯升高(P＜0.05)，TC有上升趨勢，但差異不顯著(P＞0.05);給予抗衰老片和首烏延壽片后，均不同程度降低衰老大鼠 TG和 TC，與模型對照組比，各給藥組TG降低顯著(P＜0.05)，模型對照組和各給藥組的GLU均無明顯變化(表1)。

2.2 D-半乳糖致衰老大鼠的肝腎功能與中藥干預(yù)的影響

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠肝腎功能指標(biāo)中血清 BUN明顯上升(P＜0.01)，血清AST、ALP、CREA呈上升趨勢(P＞0.05)，ALT和UA未見明顯變化;而給予抗衰老片和首烏延壽片后，衰老大鼠血清AST、BUN、CREA和UA水平均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，血清ALP、ALT亦有下降趨勢(P＞0.05)(表2)。

表1 D－半乳糖致衰老大鼠的糖代謝和脂代謝與中藥干預(yù)的影響(n=12)Tab.1 The glucose metabolism and lipid metabolism of ageing rat induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

表2 D－半乳糖致衰老大鼠的肝腎功能與中藥干預(yù)的影響(n=12)Tab.2 Liver and renal function of ageing rat induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

2.3 D-半乳糖致衰老大鼠肝腎組織中的 SOD活性和MDA含量及中藥干預(yù)的影響

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠肝腎組織SOD活性明顯降低(P＜0.05)，腎組織MDA含量明顯升高(P＜0.05);肝組織MDA含量亦有升高趨勢(P＞0.05)。給予抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，衰老大鼠肝腎組織SOD活性和MDA含量均有不同程度地改善，其中，抗衰老片組大鼠肝腎組織MDA含量明顯下降(P＜0.05)，腎組織SOD活性明顯升高(P＜0.05)，肝組織SOD活性亦有升高趨勢(P＞0.05);首烏延壽片組大鼠肝腎組織SOD活性升高顯著(P＜0.05、P＜0.01)，MDA含量明顯下降(P＜0.05)(表3)。

2.4 D-半乳糖致衰老大鼠肝組織 Na+-K+-ATPase和Ca++-Mg++-ATPase活性與中藥干預(yù)的影響

與正常對照組比，模型對照組衰老大鼠肝組織Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性均顯著降低(P＜0.05，P＜0.01);給予抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，衰老大鼠肝組織 Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase 活 性 均 顯 著 提 高 (P ＜0.01)(表4)。

表3 D－半乳糖致衰老大鼠肝腎組織SOD活性和MDA含量與中藥干預(yù)的影響(n=12)Tab.3 SOD activity and MDA content of liver and renal tissue of ageing rat induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

表4 D－半乳糖致衰老大鼠肝組織Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase活性與中藥干預(yù)的影響(n=12)Tab.4 Na+－K+－ATPase and Ca++－Mg++－ATPase activities of liver tissue of ageing rat induced by D－galactose and interventional effect of traditional Chinese medicine(n=12)

3 討論

衰老的自由基理論認(rèn)為機(jī)體隨著年齡增大的退行性變是由于受到內(nèi)、外環(huán)境的影響以及機(jī)體抗氧化酶的活性不斷下降使體內(nèi)自由基物質(zhì)過剩的結(jié)果［7］。機(jī)體衰老時，體內(nèi)組織細(xì)胞中的自由基代謝失去平衡，自由基反應(yīng)異常或失控時會使體內(nèi)大分子物質(zhì)產(chǎn)生氧化效應(yīng)，如生物膜磷脂和不飽和脂肪酸受自由基攻擊后形成丙二醛(MDA)，再和蛋白質(zhì)交聯(lián)形成脂褐質(zhì)，引起細(xì)胞和組織的損害，造成衰老［8］。D－半乳糖致衰老是因其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被進(jìn)一步代謝而堆積，影響了細(xì)胞的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹，代謝紊亂。同時，體內(nèi)自由基增多，脂質(zhì)過氧化加深，抗氧化酶活性降低［9］，最終引起組織細(xì)胞的功能障礙，組織受損。本研究采用連續(xù)皮下注射D－半乳糖致大鼠衰老模型，造模后大鼠血脂上升、肝腎功能異常、抗脂質(zhì)過氧化的能力下降，與文獻(xiàn)報道相一致［10］，適合于衰老機(jī)制和抗衰老藥物的研究。

高脂血癥是引起動脈硬化，繼發(fā)高血壓、冠心病、腦卒中等嚴(yán)重心腦血管疾病病變的主要原因［11］，而老年人血清脂質(zhì)和脂蛋白、血糖水平有隨年齡增長而增高的傾向［12］。本研究結(jié)果顯示，造模7周后，模型對照組衰老大鼠血清TG明顯升高，TC亦有上升趨勢，給予抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，均不同程度降低衰老大鼠 TG和 TC，表明抗衰老片和首烏延壽片等中藥可以有效降低衰老大鼠血清TG，減少老年高脂血癥等疾病的發(fā)生。

研究表明，衰老大鼠肝腎組織發(fā)生退行性變化［13］，進(jìn)而影響肝腎組織代謝水平，導(dǎo)致肝腎功能下降。ALT、AST和ALP是肝組織酶譜中含量豐富的酶系，肝臟受損時，可因細(xì)胞通透性增加、細(xì)胞壞死等，使血清酶量發(fā)生變化。酶學(xué)檢測已作為肝病診斷、鑒別診斷、預(yù)后診斷及治療評價的重要依據(jù)。血清中BUN、C r及UA是目前臨床評價腎功能的重要指標(biāo)［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模7周后，模型對照組衰老大鼠血清BUN含量明顯上升，血清AST、ALP、CREA、UA亦呈上升趨勢，給予抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，均顯著降低衰老大鼠血清AST，均不同程度降低衰老大鼠血清 ALP、CREA、BUN和UA水平，ALT亦有下降趨勢，提示抗衰老片和首烏延壽片等中藥可以有效改善衰老大鼠的肝腎功能。

機(jī)體衰老過程中，組織細(xì)胞中的自由基代謝失去平衡，過多的自由基攻擊生物膜使體內(nèi)大分子物質(zhì)產(chǎn)生氧化效應(yīng)，如生物膜磷脂和不飽和脂肪酸形成丙二醛(MDA)，再和蛋白質(zhì)交聯(lián)形成脂褐質(zhì)，引起細(xì)胞和組織的損害，加速衰老［8］。超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的主要酶系之一，可以特異地清除自由基，保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷。加速細(xì)胞衰老和死亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模7周后，衰老大鼠肝、腎組織SOD活性明顯降低，腎組織MDA含量明顯升高，給予抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，抗衰老片組大鼠肝、腎組織MDA含量明顯下降，腎組織SOD活性明顯升高，首烏延壽片組大鼠肝、腎組織 SOD活性顯著升高，MDA含量顯著降低，提示抗衰老片和首烏延壽片等中藥可以有效改善衰老大鼠的自由基的代謝紊亂，抑制體內(nèi)自由基生成，減少膜脂質(zhì)過氧化，從而減少細(xì)胞氧化損傷的發(fā)生，延緩細(xì)胞衰老和死亡。

自由基可直接氧化膜脂質(zhì)形成大量過氧化脂質(zhì)，與 ATP酶蛋白氨基酸殘基，使 Na+－K+－ATPase和Ca++－Mg++－ATPase活性降低，影響細(xì)胞內(nèi)Na+及Ca++的分布，導(dǎo)致 Ca++超載［15］，加速細(xì)胞衰老和死亡。本研究結(jié)果顯示，衰老大鼠肝組織 Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性均顯著降低，給予抗衰老片和首烏延壽片干預(yù)后，衰老大鼠肝組織Na+－K+－ATPase和 Ca++－Mg++－ATPase活性均顯著提高，進(jìn)一步說明抗衰老片和首烏延壽片可以提高肝組織的抗脂質(zhì)過氧化的能力，提示抗衰老片和首烏延壽片等中藥的抗衰老作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。

［1］ 楊振軍，謝紅林，李皓巖，等.中藥天年飲對衰老大鼠肝功能的保護(hù)作用［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(3):536－537.

［2］ 楊青，馮芬，易無庸，等.保腎湯抗大鼠D－半乳糖致衰老作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2004，11(3):164－165.

［3］ 方征宇，柏珊，賈萬鈞，等.自由基損傷與血糖、血脂及年齡關(guān)系的研究［J］.老年學(xué)雜志，1992，12(1):20－22.

［4］ 白瑜，周忠友，張玉玲，等.中藥對衰老大鼠免疫功能的影響及肝細(xì)胞的電鏡觀察［J］.新中醫(yī)，2007，39(11):104－106.

［5］ 邱柏程，劉慶豐.D－半乳糖大鼠衰老模型的評價［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2009，31(7):918－920.

［6］ 李儀奎，金若敏，王欽茂.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第2版)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，2006:992－994.

［7］ Harman D.Aging.a theory based on free radical and radiation chemistry［J］.J Gerontol，1956，11(1):298－300.

［8］ Del Rio D，Stewart AJ，Pellegrini N.A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress［J］.Nutr Metab Cardiovasc Dis，2005，15(4): 316－328.

［9］ 龔國清，徐黻本.小鼠衰老模型研究［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，1991，22(2):101－103.

［10］ 張熙，李文彬，張炳烈.D－半乳糖亞急性中毒大鼠擬衰老生化改變［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，1990，4(4):309－310.

［11］ Lakatta EG， Levy D. Arterialand cardiac aging:major shareholders in cardiovascular disease enterprises:Part I:aging arteries:a“set up”for vascular disease［J］.Circulation，2003，107(1):139－146.

［12］ 白斯琴，商彥衛(wèi)，李莉.呼和浩特高等院校966例中老年教職工血脂、血糖水平調(diào)查［J］.高校保健醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐，2005，2(2):42－45.

［13］ 徐輝，魏曉東，歐芹，等.D－半乳糖衰老模型大鼠肝臟形態(tài)學(xué)及抗氧化能力變化的研究［J］.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2005，28(5):42－45.

［14］ 周凌輝，黃悅.慢性腎病患者唾液尿素氮、肌酐、尿酸測定(附80例分析)［J］.福建醫(yī)藥雜志，2007，29(3):115－117.

［15］ Viner RI， Ferrington DA， Williams TD， etal. Protein modification during biological aging:selective tyrosine nitration of the SERCA2a isoform of the sarcoplasmic reticulum Ca2+－ATPase in skeletal muscle［J］.Biochem J，1999，340(3):657－669.

Liver and Renal Function and Free Radical Metabolism of Ageing Rat Model Induced by D-galactose and Interventional Effect of Traditional Chinese Medicine

AI Xiu－feng，CHEN Min－li，PAN Yong－ming，ZHU Ke－yan，XIAO Hui，YU Jia，XIE Ri－qing，LENG Xiao－xia，TAO Tao
(Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center，Hangzhou 310053，China)

ObjectiveTo observe the changes of glucose and lipid metabolism，the liver and renal function and the free radical metabolism of ageing rat model induced by D－galactose and to study the effect of traditional Chinese medicine on anti－ageing mechanism. Methods The ageing rat model was established by injecting D－galactose subcutaneously every day for seven weeks，meanwhile the rats in administration groups were given anti－ageing tablets and Shouwu Yanshou tablets respectively.At the end of the experiment，the glucose and lipid metabolism，the liver and renal function and SOD，MDA，Na+－K+－ATPase and Ca++－Mg++－ATPase were determined。ResultsAfter seven weeks，TG and BUN of the ageing rat in model control group significantly increased(P＜0.05，P＜0.01)，the content of serum AST，ALP and CREA increased(P＞0.05)，SOD activity of the liver and renal tissue decreased significantly(P＜0.05)，the content of MDA of the renal tissue increased obviously(P＜0.05)，the Na+－K+－ATPase and Ca++－Mg++－ATPaseactivities of the liver tissue descended remarkably(P＜0.05，P＜0.01).After treatment of anti－ageing tablets and Shouwu Yanshou tablets，the content of serum TG，AST，BUN，CREA and UA significantly suppressed(P＜0.05，P＜0.01)，the content of MDA of liver and renal tissue of ageing rats decreased remarkably(P＜0.05)，SOD activity increased remarkably(P＜0.05，P＜0.01)，the Na+－K+－ATPase and Ca++－Mg++－ATPase activities of the liver tissue ascended remarkably(P＜0.01)。Conclusions The content of blood lipid of ageing rat model induced by D－galactose increases，the liver function and renal function are abnormal，the capability of anti－lipid peroxidation decreases，anti－ageing tablets and Shouwu Yanshou tablets can improve effectively the glucose and lipid metabolism and the liver and renal function，and enhance the capability of anti－lipid peroxidation of liver and renal tissue，which suggest that the anti－ageing effect of traditional Chinese medicine may be related to their antioxidation.

D－galactose;Ageing rat;Liver and renal function;Free radical;Traditional Chinese medicine (TCM)

R332;R285.5

A

1671－7856(2010)05－0041－05

2009－12－24

浙江省中醫(yī)“治未病”研究專項(xiàng)(2007WB022);“浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目”資助。

艾秀峰，男，碩士生。

陳民利(1963－)，女，教授、碩導(dǎo)，研究方向:比較醫(yī)學(xué)。E－mail:minlichen01@yahoo.com.cn