不同濃度血府逐瘀湯含藥血清對大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲的影響

林 薇，趙錦燕，鄭良樸，曹治云，陳旭征，葉蕻芝

(1.福建中醫學院福建省高校中西醫結合基礎重點實驗室(福建中醫學院)，福州 350108; 2.福建中西醫結合研究院，福州 350108)

研究報告

不同濃度血府逐瘀湯含藥血清對大鼠血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲的影響

林 薇1，2，趙錦燕1，2，鄭良樸1，2，曹治云2，陳旭征2，葉蕻芝2

(1.福建中醫學院福建省高校中西醫結合基礎重點實驗室(福建中醫學院)，福州 350108; 2.福建中西醫結合研究院，福州 350108)

目的觀察不同濃度血府逐瘀湯含藥血清對大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMCs)增殖、遷移及侵襲的影響，以及其生成一氧化氮(NO)的情況。方法用MTT法觀察VSMCs的增殖，Transwell小室法觀察VSMCs的遷移、侵襲，并檢測培養上清液一氧化氮(NO)的含量。結果與空白對照組比較，5%血府逐瘀湯組能顯著促進VSMCs的增殖(P＜0.05)，20%，30%血府逐瘀湯組能顯著抑制VSMCs的增殖(P＜0.05);與空白對照組比較，培養48 h的培養上清液中，血府逐瘀湯組的NO水平有顯著升高(P＜0.01)，且與血府逐瘀湯含藥血清的濃度有劑量依賴關系。結論低濃度(＜10%)血府逐瘀湯含藥血清有促進 VASMCs增殖和遷移、侵襲的作用，高濃度(＞10%)血府逐瘀湯含藥血清有抑制VASMCs增殖、遷移和侵襲的作用，其作用可能與上清液的NO水平有關。

血府逐瘀湯;血管平滑肌細胞;增殖;遷移;侵襲

血管平滑肌細胞是構成血管壁組織結構及維持血管張力的主要細胞成分，其粘附、鋪展和遷移時導致血管重建發生發展的關鍵環節。其結構及功能的改變是導致高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術后在狹窄等多種心血管病的細胞病理學基礎。相關研究發現血府逐瘀湯既有促血管生成的作用［1］，又能預防經皮血管腔內成形術后再狹窄的作用。筆者通過實驗觀察不同濃度血府逐瘀湯含藥血清對血管平滑肌細胞增殖、遷移及侵襲的影響及NO濃度的變化，初步探討其作用機理。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

SD大鼠12只，6周齡，體重150±20 g，雌雄各半，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物批號:0037614，SPF級，經福建中醫學院實驗動物中心清潔級動物房飼養［SYXK(閩)2005－0004］，自由飲水，普通飼料喂養，適應性飼養3 d。

1.2 藥物制備

血府逐瘀湯中各藥量為:當歸9 g，生地黃9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗4.5 g，川芎4.5 g，牛膝9 g，購自福建中醫學院國醫堂藥房。該方水煎2次，煎液過濾，混合后加熱濃縮至含生藥量1.3 g/mL，4℃保存備用。

1.3 試劑及設備

DMEM高糖培養液、南美胎牛血清、胰蛋白酶－EDTA、磷酸鹽緩沖液 (美國Hyclone公司);明膠，戊巴比妥鈉(Pentobarbital Sodium)(美國，SIGMA公司);四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) (美國Amresco公司);boyden小室(江蘇省海門市麒麟醫用儀器廠);培養瓶、培養板 (美國，Corning公司);一氧化氮(NO)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);半自動生化分析儀(意大利生物技術公司);超凈工作臺(江蘇蘇州凈化設備公司);CO2培養箱(德國，Heraeus公司);IX70倒置相差顯微鏡及數碼攝像裝置(日本，OLYMPUS公司)。

1.4 含藥血清制備

血府逐瘀湯組(XFZYD)分別用中藥6.5 g/kg灌胃，空白對照組(control)用6.5 g/kg生理鹽水灌胃，每日2次，連續灌胃7 d，于第7天灌胃2 h后，以3%戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，靜置1 h后，3000 r/min離心15 min分離血清，經56℃、30 min滅活后，用0.22 μm過濾除菌，置－20℃保存。

1.5 大鼠血管平滑肌細胞培養

大鼠平滑肌細胞(麥莎生物技術公司)，用含10%FBS的 DMEM高糖培養液，置于 37℃、5% CO2培養箱培養。

1.6 MTT實驗

靜止的大鼠血管平滑肌細胞以1×104個/mL的密度懸浮于10%FBS DMEM高糖培養液中，接種于96孔板中，培養24 h后，分別用5%、10%、20%、30%的血府逐瘀湯含藥血清和空白對照血清干預。于37℃、5%CO2培養箱中分別培養12、24、36、48 h后，加入MTT溶液10 μL(終濃度5 mg/mL)，孵育4 h后棄去上清液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，于酶標儀上570nm檢測吸光度(A)。

1.7 遷移實驗

靜止的大鼠血管平滑肌細胞懸浮于無血清DMEM高糖培養液中，培養體系為5%、10%、20%、30%的血府逐瘀湯含藥血清和空白對照血清。于37℃、5%CO2培養箱中分別培養48 h后，收集細胞培養上清液將其置于boyden小室的下室，中間置以孔徑8 μm的聚碳酸酯膜，上室加入靜止的大鼠血管平滑肌細胞2×104個，于37℃、5%CO2培養箱中培養1 h。聚碳酸酯膜上膜的細胞以棉簽輕輕刮去，下膜以中性甲醛固定，蘇木素常規染色，400×視野隨機計數6個視野細胞數。

1.8 侵襲實驗

Boyden小室中間置以孔徑8 μm的0.5%明膠包被24 h的聚碳酸酯膜，其他步驟同遷移實驗。

1.9 NO含量的檢測

收集細胞培養上清液，參照試劑盒說明書進行含量測定。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 不同濃度血府逐瘀湯對大鼠血管平滑肌細胞增殖的影響

與空白對照組比較，5%、10%血府逐瘀湯含藥血清作用12 h、24 h時，對大鼠血管平滑肌細胞增殖沒有顯著影響;作用36 h、48 h時，可顯著促進大鼠血管平滑肌細胞增殖(P＜0.05);20%、30%血府逐瘀湯含藥血清作用12 h、24 h時，均不能抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖;作用36 h時，均可抑制大鼠血管平滑肌細胞增殖(P＜0.05)(表1)。

表1 各組吸光度值的比較(n=8)Tab.1 The absorb value of various groups(n=8)

2.2 不同濃度血府逐瘀湯對大鼠血管平滑肌細胞遷移、侵襲的影響

與空白對照組比較，5%的血府逐瘀湯含藥血清干預后，遷移、侵襲到下層膜的細胞數有顯著升高(P＜0.05);10%的血府逐瘀湯含藥血清干預后，遷移到下層膜的細胞數有顯著升高(P＜0.01)，侵襲到下層膜的細胞數無明顯變化;20%、30%的血府逐瘀湯含藥血清干預后，遷移、侵襲到下層膜的細胞數均有顯著升高(P＜0.01)(表2)。

表2 各組遷移、侵襲到下層膜的細胞數的比較(n=6)Tab.2 The migration and invasion assay of various groups(n=6)

2.3 血府逐瘀湯對培養上清液NO的影響

與空白對照組比較，各濃度的血府逐瘀湯含藥血清培養細胞48 h的上清液中NO水平都有顯著升高(P＜0.01)，且與血府逐瘀湯含藥血清的濃度有劑量依賴關系(表3)。

表3 各組培養上清液NO含量的比較(n=6)Tab.3 The NO in supernatant various groups(n=6)

3 討論

血府逐瘀湯出自清代王清任《醫林改錯》，具有疏肝理氣、活血化瘀功效，原著論述可治20種瘀血之證，是目前在血瘀證應用中最具有代表性臨床方劑。血清藥理學方法被廣泛地應用于中藥的藥理學研究，適合在細胞、亞細胞、分子水平對中藥及中藥復方進行深入的機制研究［2］。新生內膜形成是局部血管損傷的一種過修復反應，在高血壓、動脈粥樣硬化、冠脈搭橋術后移植血管及血管成形術后局部血管的再狹窄等多種損傷性血管疾病的病理過程中均扮演重要角色，眾多血管活性物質及生長因子均參與其復雜生物學過程。新生內膜形成與血管重塑之間的穩態失衡是導致血管再狹窄的重要因素，從血管內皮細胞損傷、血管平滑肌細胞增殖等方面探討新生內膜形成和再狹窄的分子機制已成為目前研究的熱點［3，4］。本實驗應用血府逐瘀湯含藥血清干預大鼠血管平滑肌增殖、遷移及侵襲，結果表明5%血府逐瘀湯含藥血清對大鼠血管平滑肌增殖、遷移及侵襲有顯著的促進作用，20%和30%血府逐瘀湯含藥血清對其有顯著的抑制作用。研究提示血府逐瘀湯可能是通過抑制血管平滑肌增殖、遷移或者侵襲來抑制血管成形術后局部血管的再狹窄的發生，或者抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成;同時血府逐瘀湯也有可能是通過促進血管平滑肌細胞增殖、遷移或者侵襲來參與到新生內膜形成，這兩者間平衡調節有待于進一步的研究。

血管內皮損傷所引發的血管平滑肌細胞(VSMCs)粘附、增生及向內膜下遷移，其機制非常復雜，眾多的細胞因子參與其中，但迄今尚未明確其作用機理［5，6］。NO是血管內皮分泌的最重要的一種內皮源性血管活性因子，在許多血管病變的病理生理過程中起著重要的作用［7］，具有廣泛的生物學效應。近年發現它在腫瘤研究中發現NO的水平是其作用機制的關鍵因素，且NO對腫瘤的發生、發展有促進和抑制的雙向調節作用［8］;在調節血管SMCs增殖、凋亡、遷移及血管基質形成方面也具有重要作用［9］。本實驗結果表明不同濃度的大鼠血管平滑肌細胞的培養上清液中NO的含量有顯著變化，且與血府逐瘀湯含藥血清的濃度有劑量依賴關系，從而推測 NO濃度可能是其調節作用的關鍵。NO在血管SMCs增殖、凋亡、遷移及血管基質形成方面是否也具有促進和抑制的雙向調節作用以及如何通過 NO水平來發揮作用有待進一步深入研究。

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Effect of Different Concentration of XueFuZhuYu Decoctions on Proliferation，Migration and Invasion of Vascular Smooth Muscle Cells in Rats

LIN Wei1，2，ZHAO Jin－yan1，2，ZHENG Liang－pu1，2，CAO Zhi－yun2，CHEN Xu－zheng2，YE Hong－zhi2
(1.Fujian Academy of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350108，China; 2.Fujian Academy of Integrative Medicine，Fuzhou 350108，China)

ObjectiveTo observe effect and nitrogen monoxidum of different concentrations XueFuZhuYu decoction on proliferation，migration and invasion of vascular smooth muscle cells in rats。MethodsMTT assay was used to view proliferation of VSMCs.Cell migration and invasion was determined by Transwell assay，contents of nitrogen monoxidum in supernatant were detected。ResultsCompared with blank group，5%XueFuZhuYu Decoction could promote proliferation，migration and invasion(P＜0.05)，20% and 30% XueFuZhuYu decoction could inhibit proliferation，migration and invasion(P＜0.05).Contents of nitrogen monoxidum in all dose groups were significantly elevated after culturing 48 hours(P＜0.01)。Conclusions Low concentration(＜10%)serum containing XueFuZhuYu decoction could promote proliferation，migration and invasion，high concentration(＞10%)could inhibit proliferation，migration and invasion.The effect was related with contents of nitrogen monoxidum.

XueFuZhuYu decoction;Vascular smooth muscle cells;Proliferation;Migration;Invasion

R－33

A

1671－7856(2010)05－0057－04

2009－12－17

福建省自然基金資助課題(2009J01173)，福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室開放課題(CKJ2008061)。

林薇(1974－)，女，助理研究員，主要從事生化與免疫的研究。

葉蕻芝(1968－)，女，副研究員。E－mail:yelin0930@163.com