大鼠急性心肌梗死模型的制備及對肌鈣蛋白T的影響

郝 迪，王 蕾，李 旭，種影影，呂 楠，康 利，陳衛(wèi)平

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

研究報(bào)告

大鼠急性心肌梗死模型的制備及對肌鈣蛋白T的影響

郝 迪，王 蕾，李 旭，種影影，呂 楠，康 利，陳衛(wèi)平

(天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020)

目的探討建立大鼠急性心肌梗死(AMI)模型的方法，研究心肌梗死大鼠血漿中肌鈣蛋白 T(cTn－T)的動態(tài)變化。方法大鼠經(jīng)結(jié)扎左冠狀動脈前降支造成心肌梗死，建立穩(wěn)定的心肌梗死模型;分別在結(jié)扎后31 h、48 h、69 h、168 h檢測cTn－T含量和計(jì)算心肌梗死重量指數(shù) 。結(jié)果成功制備心肌梗死大鼠模型，并對常規(guī)技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，降低動物死亡率。大鼠左冠狀動脈結(jié)扎31 h、48 h模型組與假手術(shù)組 cTn－T含量差異極顯著(P ＜0.001);各時(shí)間點(diǎn)心肌梗死重量指數(shù)比較，差異極顯著(P＜0.001)。cTn－T值與梗死重量指數(shù)呈顯著性正相關(guān)(r =0.90，P＜0.01)。結(jié)論結(jié)合大鼠心肌梗死程度進(jìn)一步佐證了模型制備較成功。cTn－T表現(xiàn)出特異性和敏感性，并在31 h最接近達(dá)峰時(shí)間，有早期診斷心肌梗死的價(jià)值，也可作為判斷AMI時(shí)心肌梗死程度和預(yù)后的參考指標(biāo)。

急性心肌梗死;肌鈣蛋白T;大鼠

心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常見的心血管內(nèi)科疾病，嚴(yán)重危害著人類的健康。心肌梗死后梗死區(qū)域內(nèi)心肌細(xì)胞的變性壞死、梗死邊緣處組織的轉(zhuǎn)變以及心肌細(xì)胞壞死后的不能再生，這些原因可引起心室重構(gòu)、心輸出量減少，影響局部或整體的心功能，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。人們常利用心臟是區(qū)域性供血的特點(diǎn)，結(jié)扎主要的一條冠狀動脈分支，中斷血流，導(dǎo)致某一區(qū)域心肌的壞死，制備AMI模型，再現(xiàn)體內(nèi)病理狀態(tài)和病理生理過程。動物實(shí)驗(yàn)中主要是結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支(LAD)作為最常用的AMI模型，但制備該類模型中面臨的最大問題就是死亡率仍然較高［1，2］，本文就如何建立較為穩(wěn)定的大鼠 AMI模型并降低死亡率提出了一些建議。肌鈣蛋白T(cTn－T)被視為AMI新的診斷標(biāo)志物，對其研究越來越受到重視，最近，歐洲心臟病學(xué)會(ESC)、美國心臟病學(xué)會(ACC)對AMI進(jìn)行了重新定義［3］，將 cTn－T增高作為診斷心肌損傷的最主要條件。為此，筆者特對 cTn－T在AMI中的早期診斷意義進(jìn)行探討，旨在通過對大鼠AMI模型技術(shù)的改進(jìn)建立的大鼠急性心肌梗死模型，從cTn－T和心肌梗死變化方面檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建情況，觀察其變化規(guī)律并找出其血漿峰值的敏感時(shí)間以期對研究缺血性心臟病動物模型提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部［SCXK(京)2006－0008］，雄性，體重220±10 g。每天為大鼠提供普通全價(jià)顆粒飼料II號，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)［京動許字(2000)第015號］。動物飲用純凈水。標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(津)2007－0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:取健康大鼠56只，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)對照組和AMI模型組，每組28只，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取7只。

1.2.2 大鼠AMI模型制作:SD大鼠經(jīng)1% 戊巴比妥鈉45～50 mg/kg腹腔注射麻醉后，背位固定于手術(shù)臺上，無菌操作下沿大鼠左腋下與胸骨劍突連線處切開皮膚，逐層鈍性分離肌肉，將面罩罩住大鼠口鼻連接人工呼吸機(jī)(參數(shù)設(shè)定為:呼吸比1∶3，潮氣量32，呼吸頻率60)，沿4、5肋間開胸，分離心包膜，擠出心臟至可見肺動脈圓錐，以0號線于左心耳根部下方2 mm處進(jìn)針，在肺動脈圓錐旁出針，深度為0.3～0.5 mm結(jié)扎LAD［4］，心臟復(fù)位后迅速擠出空氣關(guān)閉胸腔，制造胸腔負(fù)壓狀態(tài)，縫合肌肉皮膚。假手術(shù)對照組在相同條件下，穿過針線后不結(jié)扎。術(shù)后測定Ⅱ?qū)?lián)心電圖，以心電圖作為大鼠AMI納入標(biāo)準(zhǔn)，若術(shù)后心電圖 ST段抬高較術(shù)前未超過0.2 mV且QRS波群無明顯變化，則為模型未成功不納入試驗(yàn)使用。

1.2.3 心梗后不同時(shí)間測定 cTn－T:分別在心梗后31 h、48 h、69 h和168 h腹主動脈取血，測定血漿中cTn－T含量。

1.2.4 心肌梗死大鼠梗死重量指數(shù):分別在不同時(shí)間點(diǎn)將心臟取下，用生理鹽水沖洗3遍，除去血污，剔除血管、脂肪等非心肌組織，用濾紙吸除水分，沿冠狀溝切除心房和右心室，留下左心室。順房室溝從心尖到心室底部平行將左心室切成0.1 cm厚的心肌片。切片后將左心室放在0.2%NBT溶液中37℃水浴環(huán)境染色5 min，梗死區(qū)域呈現(xiàn)未染色的灰白色，未梗死區(qū)域呈現(xiàn) NBT與脫氫酶反應(yīng)后的藍(lán)色，切下灰白色區(qū)域稱重即為梗死心肌重量，再稱取非梗死心肌重量，與梗死心肌重量相加計(jì)算得出左心室重量，用梗死心肌重量/左心室重量，即為梗死重量指數(shù)［5］。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所得數(shù)據(jù)均經(jīng) SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件組間t檢驗(yàn)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，cTn－T與梗死重量指數(shù)比較采用直線相關(guān)回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 冠脈結(jié)扎大鼠不同時(shí)間段梗死重量指數(shù)

實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌梗死重量指數(shù)均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.001)，該心肌梗死模型制備較成功(表1)。

表1 AMI大鼠不同時(shí)間段梗死重量指數(shù)Tab.1 Infarct ponderal index in deferent time in AMI rats

2.2 肌鈣蛋白

模型組cTn－T在31 h和48 h與假手術(shù)組有顯著性差異，即該手術(shù)方法較成功，且在31 h最接近達(dá)峰時(shí)間，可見cTn－T出現(xiàn)的時(shí)間早，特異性和敏感性強(qiáng)，可以作為早期診斷AMI的指標(biāo)(表2)。

表2 AMI大鼠不同時(shí)間段肌鈣蛋白含量Tab.2 The vale of cTn－T in deferent time in AMI rats

2.3 cTn-T與梗死重量指數(shù)關(guān)系

cTn－T值與梗死重量指數(shù)呈顯著正相關(guān)(r= 0.90，P＜0.01)。

3 討論

動物實(shí)驗(yàn)中觀察 AMI指標(biāo)的敏感性和參考價(jià)值直接取決于如何建立穩(wěn)定的急性大鼠AMI模型，減少動物死亡率，從而進(jìn)行缺血性心臟病其它指標(biāo)的研究。本文就大鼠心梗模型建立過程進(jìn)行了大樣本探索，就經(jīng)驗(yàn)提出幾點(diǎn)建議:1.采用結(jié)扎冠狀動脈制備心肌梗死模型首先要過麻醉關(guān)。因該模型制備需時(shí)較長，故采用腹腔注射麻醉，較為方便、實(shí)用。我們使用的麻醉藥物有戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉，大鼠術(shù)后蘇醒快，無呼吸道分泌物，無麻醉意外，死亡率低。實(shí)驗(yàn)中我們主張，麻醉要一次到位，中途加量往往使動物蘇醒時(shí)間延長至少1 h，影響大鼠存活率。我們發(fā)現(xiàn)，凡麻醉效果好、蘇醒及時(shí)的大鼠，死亡率就低。2.本模型最關(guān)鍵的一步是LAD的定位及結(jié)扎。因此，如何準(zhǔn)確結(jié)扎冠脈及早期判斷模型成功與否，值得深入研究。實(shí)驗(yàn)中一些大鼠造模后死亡，解剖發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎過于靠上、過緊，造成心衰而死亡。結(jié)扎時(shí)要快、準(zhǔn)，打結(jié)時(shí)不宜過度牽拉;否則，易切割心肌組織，造成嚴(yán)重的心肌損傷。開胸結(jié)扎完心臟后迅速放入胸腔，并用止血鉗及時(shí)關(guān)閉胸腔，時(shí)間短暫，可不用氣管插管。3.觀察心電圖是否逐漸出現(xiàn)ST段弓背向上抬高及病理性Q波等指標(biāo)作為納入標(biāo)準(zhǔn)。4.心律失常的預(yù)防及處理術(shù)，給利多卡因10 mg/kg預(yù)防室性心律失常，術(shù)中、術(shù)后出現(xiàn)者可隨時(shí)補(bǔ)加，若出現(xiàn)室速、室顫，應(yīng)同時(shí)給予胸外擠壓，一般可糾正。出現(xiàn)過緩性心律失常，可給予阿托品、異丙腎予以糾正，但對于合并術(shù)后心電圖 R波迅速降低者，說明梗死面積過大，搶救少有成活者。5.術(shù)后感染的預(yù)防及控制 術(shù)前可將所有手術(shù)器械高壓滅菌，臨使用前用75% 酒精消毒。將手術(shù)區(qū)皮毛剃干凈后，先用碘酒涂擦，再用酒精消毒皮膚 手術(shù)切口盡量小，術(shù)后給青霉素3 d至一周。

cTn－T作為一種新型AMI診斷標(biāo)志物，由于其出現(xiàn)時(shí)間早、高特異性、高敏感性，因而具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值，成為臨床上早期判斷心肌梗塞的重要依據(jù)。CTn是緊密附著于收縮纖維上的調(diào)節(jié)蛋白，由3個(gè)亞基組成:肌鈣蛋白T(cTn－T)、肌鈣蛋白I(cTn－I)、肌鈣蛋白C(cTn－C)。cTn－T和cTn－I心肌特異性好，已作為胸痛患者首選的常規(guī)心肌壞死標(biāo)志物檢查。心肌中的cTn－C與骨骼肌中的cTn－C相同，沒有心肌特異性，較少用于心肌損傷的檢查。cTn－T在心肌壞死時(shí)釋放入血［6，7］，是心肌損傷最特異的診斷指標(biāo)，cTn－I也是心肌損傷特異性標(biāo)志物，其性質(zhì)與意義和 cTn－T相同，在 AMI后出現(xiàn)的時(shí)間、高峰時(shí)間與 cTn－T平行。本動物實(shí)驗(yàn)著重觀察了 cTn－T在心肌梗塞大鼠中的動態(tài)變化。cTn－T在心肌細(xì)胞膜完整狀態(tài)下，不能透過細(xì)胞膜進(jìn)入血循環(huán)，故假手術(shù)組大鼠血液中含極低量的肌鈣蛋白，當(dāng)大鼠左冠狀動脈結(jié)扎后，心肌細(xì)胞發(fā)生變性壞死，細(xì)胞膜破損，cTn－T彌散進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì)，較早地出現(xiàn)在外周血中。研究其在大鼠心肌梗死中出現(xiàn)的動態(tài)變化，可以最早佐證心肌梗死動物模型建立成功，節(jié)省動物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在31 h左右 cTn－T較其他時(shí)間點(diǎn)更接近達(dá)峰時(shí)間。鑒于cTn－T的敏感性與特異性較其他心肌酶高，故建議可以選擇31 h左右作為心梗實(shí)驗(yàn)中檢測 cTn－T時(shí)間，也有利于評價(jià)藥物療效。本文結(jié)果證實(shí)，cTn－T值與梗塞重量指數(shù)有較好的相關(guān)性，呈顯著正相關(guān)，提示在不同的實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)中，通過測定cTn－T，可以動態(tài)監(jiān)測和評價(jià)AMI變化。

從AMI的臨床表現(xiàn)來看，一些患者可能不完全符合WHO關(guān)于AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)，但卻伴有心肌損傷標(biāo)志物cTn－T升高，美國心臟病學(xué)學(xué)會(ACC)以及美國心臟學(xué)會(AHA)認(rèn)為在心肌梗死患者中，cTn－T值升高可確立ST段未升高的AMI的診斷，因此，在后繼的研究中我們將進(jìn)一步研究只納入 ST段未升高的LAD結(jié)扎大鼠cTn－T的含量，從而進(jìn)一步探討cTn－T在AMI早期診斷中的重要意義。

［1］ Lee BH.Kim WH，Choi MJ，et al.Chronic heart failure model inrabbits based on the concept of the bifurcation/trifurcation coronary artery branching pattern［J］.Artif Organs，2002，26(4): 360－365.

［2］ Degabriele NM，Gfiesenbach U，Saw K，et al.Critical appraisal of the mouse model of myocardial infarction［J］.Exp Physic1，2004，89(4):497－505.

［3］ The Joint European Society of Cardiology/American college of Cardiology Committee. Myocardial infarction redefined A consensus document of the Joint European Society of Cardiology/ American college of cardiology Committee for the redefinition of myocardialinfarction［J］.J Am CoilCardial，2000，36:950－969.

［4］ 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2000:462.

［5］ 盧新政，王連生，黃峻，等.冠狀動脈堵閉法建立豬心肌梗死模型［J］.中國動脈硬化雜志，2004，12(2):218－220.

［6］ Bodor GS，Poter S，Landt Y.The development of monoclonal antibodies and an assay for cardiac troponin I with preliminary results in suspected myocardial infarction［J］.Clin Chem，1992，11:2203－2214.

［7］ Wu AH.A comparison of cardiac troponin T and cardiac troponin I in patients with acute coronary syndromes［J］.Coron Artery Dis，1999，10:69－74.

Model Establishment of Acute Myocardial Infarction and Its Effects on cTn-T

HAO Di，WANG Lei，LI Xu，CHONG Ying－ying，LV Nan，KANG Li，CHEN Wei－ping
(Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Sciences，Tianjin 300020，China)

ObjectiveTo establish the model of AMI rats and to evaluate the dynamic changing of cTn－T. Methods Model of myocardial infarction were established by ligation of the left anterior descending branch，then detected cTn－T and infarct weight after ligating 31 h，48 h，69 h，168 h on AMI rats。ResultsThere was remarkable difference of cTn－T between model group and sham operation group at 31 h and 48 h(P ＜0.001);infarct weight of model group was higher than that of sham operation group(P ＜0.001).Blood plasma cTn－T peak value showed positive correlation with the infarct ponderal index(r=0.90，P ＜0.01)。Conclusions The variability of cTn－T plays an important role on early diagnosis in AMI，the value of cTn－T is a reference index for estimating infarction and prognosis.

Acute myocardial infarction;cTn－T;Rat

R542.2+2

A

1671－7856(2010)05－0021－03

2009－12－04

郝迪(1977－)，從事心腦血管藥物研發(fā)。

陳衛(wèi)平(1953－)，副教授，從事心腦血管藥物研發(fā)。