川芎嗪對癡呆小鼠模型學習記憶能力的影響

袁樹民，曹興水，高 翔，張海濤，張連峰，秦 川

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

研究報告

川芎嗪對癡呆小鼠模型學習記憶能力的影響

袁樹民，曹興水，高 翔，張海濤，張連峰，秦 川

(中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021)

目的研究川芎嗪對癡呆小鼠學習記憶的影響。方法對 APPswe/PSΔE9雙轉基因小鼠在3月齡開始食物中連續給川芎嗪(100 mg/kg·d)進行治療，停藥后立即進行水迷宮實驗，并與未給藥 APPswe/PSΔE9雙轉基因小鼠和及野生鼠進行比較。結果治療組與APPswe/PSΔE9雙轉基因組比較，平臺尋找潛伏期縮短，穿過原平臺區的頻次增加。結論川芎嗪能改善APPswe/PSΔE9癡呆模型小鼠的學習記憶能力。

阿爾茨海默病;川芎嗪;Morris水迷宮

老年性癡呆(Alzheimer disease，AD)是一種慢性神經退行性疾病，主要表現為認知功能障礙。其病理特征為相對特異性的老年斑、神經纖維纏結并伴有神經元的喪失。隨著全世界老齡人口的快速增長，AD的治療已成為亟待解決的重要問題［1，2］。目前主要的治療措施:膽堿酯酶抑制劑治療、基因載入治療、抗氧化劑治療、他汀類藥物治療 、非甾體抗炎藥治療、激素替代療法、阻斷興奮性中毒、疫苗治療 、免疫治療。這些治療措施，能夠短暫提高記憶力，但由于自身的局限性而很難在臨床長期應用［3］。因此開發新的治療藥物成為當前研究的熱點之一。川芎嗪(Chuanxiongzine)，別名四甲基吡嗪(tetramethylpyrazine，TMPZ)，主要來源于植物川芎的根莖，具有抗血小板聚集、擴張小動脈、改善微循環和腦血流的作用，臨床主要用于閉塞性血管疾病、腦血栓形成、脈管炎、冠心病、心絞痛等。以往的動物實驗研究中，多采用D-半乳糖注射或者氯化鋁灌胃造模，得到了川芎嗪能夠改善模型鼠的學習記憶能力的結果。大鼠或小鼠給與一定濃度的鋁鹽，造成記憶行為減退，可以用來建立AD的行為模型，此種動物模型形成的神經纖維纏結中 Tau蛋白沒有磷酸化成神經纖維元纏結，且中樞膽堿能活性正常，因此，該模型不能全面反映 AD的病理機制［4］。D-半乳糖誘導形成的具有學習記憶力減退、行動遲緩毛發稀疏等老化征象的動物模型，主要用于抗衰老的研究。它可模擬AD的氧化損傷、學習記憶下降、腦內膽堿能系統功能衰退、神經遞質代謝異常、皮層和海馬神經元損傷、超微結構和突觸可塑性發生衰老性改變等，但是缺乏 AD針對性［5］。因此，一個有效的藥物應該在多種模型上進行驗證。APPswe/PSΔE9雙轉基因小鼠是 APP“瑞典家族”突變和PS1第9外顯子缺失突變兩個基因的雙轉基因小鼠。在3月齡開始就出現學習記憶損傷。4.5月齡開始出現老年斑，9～12月齡小鼠大腦出現與阿爾茨海默病患者相似的老年斑，具有和AD相似的病理表型。本實驗用 APPswe/PSΔE9雙轉基因阿爾茨海默病小鼠模型，觀察川芎嗪對該模型在水迷宮實驗中學習記憶能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料及設備

APPswe/PSΔE9雙轉基因小鼠和同窩野生型小鼠本實驗室繁育［SCXK(京)2005-0013］，共計60只，雌雄各半;川芎嗪:北京市燕京藥業有限公司生產，批號:H11021964;水迷宮設備為:荷蘭 Noldus公司 Ethovision XT監測分析軟件，Morris水迷宮系統。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥方式:小鼠分為野生小鼠組(WT)，APPswe/PSΔE9轉基因小鼠安慰劑組(TG)和APPswe/PSΔE9轉基因小鼠川芎嗪治療組(TG+ chuanxiongzine)，每組20只。三組小鼠年齡、性別、體重相匹配，對照組給予常規的 SPF鼠糧，川芎嗪組在糧食中加入0.07% 川芎嗪，按每只20 g小鼠每天攝取3 g鼠糧計算，小鼠日藥物劑量為100 mg/ kg·d，持續給藥4周。

1.2.2 Morris水迷宮實驗測試小鼠學習記憶能力:川芎嗪治療療程結束后，3組小鼠進行水迷宮實驗，圓形水池直徑為100 cm，平臺在水下0.5 cm，水溫保持在22℃ ～24℃，水中加入牛奶粉，使其不透明，在水池的上方小鼠能看到的地方張貼醒目的幾何圖形，作為小鼠尋找平臺的線索。水迷宮按東南西北分為1、2、3、4區域，平臺即第5區域，位于第4區域內。水迷宮實驗過程分為連續5 d的隱藏平臺獲得實驗和第5天的空間探索實驗兩部分。隱藏平臺獲得實驗時，每天在同一時間訓練小鼠2次，每次使同一只小鼠在不同區域下水，而不同的小鼠在相同的位置下水，每次游泳時間60 s，找到平臺，并在上面停留3 s以上者，視為找到平臺，60 s內沒有找到平臺的要將其引導到平臺上，停留15 s，小鼠沒有找到平臺按60 s計算潛伏期。每次訓練間隔1 h左右。隱藏平臺實驗結束1 h后立即進行空間探索實驗，把第五區的平臺去掉，讓小鼠在第二象限入水，主要看小鼠在平臺區出現的頻次。隱藏平臺獲得實驗檢測小鼠學習獲得能力，空間探索實驗檢測小鼠空間記憶能力［6－8］。

1.2.3 統計方法:利用SPSS16.0進行統計分析，水迷宮實驗小鼠尋找平臺的潛伏期，采用重復測量數據的方差分析［9］，空間探索實驗中在平臺區出現的頻次用單因素方差分析，數據采用均數 ±標準差表示。

2 結果

經水迷宮隱藏平臺實驗中，從實驗的第2天開始到第5天川芎嗪治療組尋找平臺的潛伏期與模型組比較明顯縮短，在第3天效果最明顯，接近野生小鼠(圖1)。在空間探索實驗中，芎嗪治療組第5天穿過平臺的次數較模型組增多，接近野生組小鼠(圖2)。說明川芎嗪治療能夠改善模型小鼠的學習記憶能力。

3 討論

我們實驗中用到的小鼠是 APPswe/PSΔE9雙轉基因小鼠，APPswe是“瑞典家族”突變，PSΔE9是PS1基因的第9外顯子缺失突變。前期研究中發現，在3月齡開始就出現學習記憶的差異。4.5月齡開始出現老年斑，9～12月齡小鼠大腦出現與阿爾茨海默病患者相似的老年斑［10］。這種腦病理變化與人類相似，可模擬AD的老年斑的形成、膠質細胞增生和突觸減少等部分神經病理特征，并表現出與 AD臨床相似的行為學障礙。轉基因模型也可以為淀粉樣蛋白變性疾病和認知功能障礙的AD病提供動物模型，用于研究AD的病因病理及抗AD藥篩選有不可替代的作用。

圖1 隱藏平臺實驗潛伏期分析Fig.1 Determination of escape latency in hidden platform acquisition training

圖2 宮空間探索實驗穿越平臺區分析Fig.2 Determinant of number of crossing of the removeD-platform area in the probe trial testing

本實驗結果顯示 APPswe/PSΔE9雙轉基因小鼠的學習記憶能力明顯低于正常對照組的小鼠，具體表現為:逃避潛伏期明顯延長，分析判斷能力低下。隱蔽平臺試驗中，川芎嗪治療組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，提示經川芎嗪治療后癡呆小鼠的學習記憶能力明顯改善。空間探索試驗結果顯示，正常對照組和川芎嗪治療組穿越原平臺區域次數均明顯多于模型組。

川芎嗪能夠擴張血管，改善微循環，在臨床中常用來治療心腦血管疾病。動物實驗表明，川芎嗪不但能抑制高血壓動物血管平滑肌細胞Ca2+內流，而且能提高Ca2+泵的活性，增加Ca2+的外流，并能阻斷血管平滑肌上的腎上腺β受體，是一個作用全面的舒血管藥物;家兔靜注可觀察到腸系膜微循環血流速度和微血管開放數目增加，因此具有明顯的改善微循環作用。臨床患者頭顱PET檢測發現，兩側頂葉和額葉代謝降低，灌注降低，川芎嗪可以通過血腦屏障，改善腦組織微循環。

Zhang等［11］利用C57BL/6J小鼠頸背部皮下注射D-半乳糖所造成的損傷模型，研究川芎嗪對學習記憶的影響，在成功造模后給予川芎嗪治療，并采用水迷宮檢測，結果證明，川芎嗪能夠顯著改善模型鼠的學習記憶能力。他們的研究顯示，川芎嗪能夠提高小鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)的活性，降低丙二醛的含量，并能夠提高乙酰膽堿酯酶(AchE)活性，上調M受體數目，因此說明川芎嗪能夠改善海馬膽堿能系統功能。趙琳等［12］利用 AlCl3灌胃和D2gal、NaNO2聯合腹腔注射造模兩種方法模擬AD動物模型，研究川芎嗪對學習記憶的影響，結果顯示川芎嗪對兩種方法誘導的AD模型鼠的學習記憶障礙均具有改善作用，并認為這種作用是川芎嗪提高了機體的抗氧化水平而實現的。我們的實驗利用雙轉基因小鼠模型，水迷實驗結果證實，川芎嗪治療能夠改善模型鼠的學習記憶能力。目前，川芎嗪改善學習記憶的功能在三種癡呆動物模型中得到證實，為其臨床研究提供有力的理論參考。

［1］ Dickson DW.Neuropathological diagnosis of Alzheimer's disease: a perspective from longitudinal clinicopathological studies［J］. Neurobiol Aging，1997，18(4 Suppl):S21－26.

［2］ Braak H，Braak E.Evolution of neuronal changes in the course of Alzheimer＇s disease［J］Neural Transm Suppl，1998，53:127－140.

［3］ Shah RS，Lee HG，Xiongwei Z，et al.Current approaches in the treatment of Alzheimer’s disease［J］.Biomed Pharmacother，2008，62:199－207.

［4］ 張雪飛.氯化鋁中毒小鼠不同腦區 M受體含量的比較觀察［J］.青海醫學院學報，2002，23(1):10－12.

［5］ 羅煥敏.一種新的老年癡呆動物模型［J］.中國老年學雜志，2003，23(3):15－17.

［6］ Shiryaev N，Jouroukhin Y，Giladi E et al.NAP protects memory，increases soluble tau and reduces tau hyperphosphorylation in a tauopathy model［J］.Neurobiol Dis，2009，34(2):381－388.

［7］ CoxMM， TuckerAM， Tang J， etal. Neurobehavioral abnormalities in the dysbindin-1 mutant，sandy，on a C57BL/6J genetic background［J］.Genes Brain Behav，2009，8(4):390－397.

［8］ Imbimbo BP，Hutter-Paier B，Villetti G，et al.CHF5074，a novel gamma-secretase modulator，attenuates brain beta-amyloid pathology and learning deficit in a mouse model of Alzheimer＇s disease［J］.Br J Pharmacol，2009，156(6):982－993.

［9］ 邱宏，金國琴，金如鋒，等.水迷宮重復測量數據的方差分析及其在SPSS中的實現［J］.中西醫結合學報，2007，5(1): 101－105.

［10］ 宗媛媛，王曉映.APPPPS雙轉基因阿爾茨海默病小鼠模型的老年斑及行為學動態分析［J］.中國比較醫學雜志，2008，18(9):9－12

［11］ Zhang C，Wang SZ，Zuo PP，etal.，Protective effectof tetramethylpyrazine on learningand memory function in D-galactose-lesioned mice［J］.J Chin Med Sci，2004，19(3): 754－760.

［12］ 趙琳，魏敏杰，何苗，等.川芎嗪對阿爾采末病模型小鼠學習記憶能力的影響及其機制初探［J］.中國藥理學通報，2008，24(8):1088－1092.

Influence of Tetramethylpyrazine on Learning and Memory in APPswe/PSΔE9 Double-transgenic AD Mouse Model

YUAN Shu-min，CAO Xing-shui，GAO Xiang，ZHANG Hai-tao，ZHANG Lian-feng，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo evaluate the protective effect of tetramethylpyrazine on the ability of learning and memory in APPswe/PSΔE9 double-transgenic mice。Methodsthe transgenic mice were administrated from 12 weeks old by mixing up the tetramethylpyrazine with food and the normal food was used as placebo control and the wild type mice was used as normal mice control.The administration was last for 4 weeks and the daily uptake was 100 mg/kg·d.Learning and memory ability was evaluated by Morris water maze for 5 days after drug withdraw。ResultsCompared with the control group，the latency for plat searching shortened and the frequency of crossing the platform in Morris water maze increased。Conclusions TMPZ treatment can improve the learning and memory ability of APPswe/PSΔE9 double-transgenic mice.

Alzheimer disease;Tetramethylpyrazine;Morris water maze

R338

A

1671-7856(2010)05-0046-04

2009-12-23

衛生部項目，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2009ZX09501－026)。

袁樹民(1973－)，男，博士，主要研究方向:神經退行性疾病病理生理學。

張連峰。E-mail:zhanglf@mail.cnilas.org

秦川。E-mail:chuanqin@vip.sina.com