中等強度跑臺運動預防去卵巢大鼠骨質疏松

卜淑敏，陳永杰，郝利科，王穎捷

(首都體育學院，北京 100088)

研究報告

中等強度跑臺運動預防去卵巢大鼠骨質疏松

卜淑敏，陳永杰，郝利科，王穎捷

(首都體育學院，北京 100088)

目的觀察中等強度跑臺運動對去卵巢大鼠骨質疏松的預防作用。方法將30只3月齡未經產雌性SD大鼠隨機分為假手術、去卵巢靜止和去卵巢運動三個組。去卵巢運動組每周進行4次時間45 min、速度18 m/min、坡度5°的跑臺訓練。實驗結束時，檢測血清雌二醇(E2)、堿性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和骨鈣素(BGP)水平以及右側游離股骨和脛骨的骨密度(BMD)和骨礦物含量(BMC);同時觀察左側股骨遠端和脛骨近端組織形態學變化。結果與假手術組比較，去卵巢靜止組大鼠血清ALP活性和BGP含量顯著升高，血清TRAP活性和E2含量顯著下降，股骨近段和遠端以及脛骨近端BMD和BMC顯著下降，股骨遠端和脛骨近端骨小梁斷裂增加、數目減少;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運動組大鼠血清E2和BGP含量顯著上升，股骨三個部位以及脛骨近端BMD和BMC顯著增加，股骨遠端和脛骨近端骨小梁斷裂減少、數目增加。結論中等強度跑臺運動能增加去卵巢大鼠血清E2和BGP含量，改善去卵巢大鼠骨組織學結構。

去卵巢大鼠;運動;骨密度;骨礦物含量，骨形態學

女性進入絕經期后，由于卵巢功能逐漸衰竭，體內雌激素(estrogen，E2)水平下降，骨生成和骨吸收代謝失衡，及易導致骨質疏松的發生［1］，目前尚無安全有效的根治辦法，因而早期預防顯得比較重要。在骨質疏松的預防方法中，運動療法以其方便、成本低、副作用少等優點日益受到醫務人員和患者的青睞。運動能調節骨量已為人們所熟知［3］，然而關于力學刺激是如何被轉換成骨細胞感知的生物學效應目前還知之甚少。切除動物雙側卵巢是目前國內外通用的復制婦女絕經后骨質疏松的經典方法［2］，鑒此，本實驗采用我們前期建立的去卵巢骨質疏松大鼠模型［4］，參考我們前期相關去卵巢大鼠研究的工作［5］，觀察了中等強度跑臺運動對去卵巢大鼠部分血清骨轉換相關指標、骨量相關指標、骨形態學指標的影響，旨在為進一步探討運動防治絕經后骨質疏松的細胞分子機制提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

血清堿性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸性磷酸酶(TRAP)購自南京建成生物工程有限公司;血清雌二醇放射免疫藥盒購自中國原子能科學研究所;血清骨鈣素(BGP)ELISA試劑盒購自美國ADL公司。DSPT－202小動物跑臺為杭州段氏制造廠生產; Thermo Multiskan MK3酶標儀為芬蘭雷勃;Olympus BX51顯微鏡為日本產;Leica軟組織切片機為德國產;XR－36雙能 x射線骨密度儀為美國 Norland公司產。

1.2 實驗動物手術和分組

健康3月齡雌性未經產 SD大鼠30只，體重(230±8)g，購自并在北京大學醫學部實驗動物科學部飼養(動物合格證號SCXK(京)2006－0008)。適應飼養1周后，隨機分為假手術組(10只)和手術組(20只)。手術前大鼠禁食12 h，按體重腹腔注射10%水合氯醛(1 mL/kg)麻醉，手術組從背部切除雙側卵巢，假手術組不切除卵巢，只切除卵巢旁與卵巢等大的脂肪組織。術后1周按體重又將手術組大鼠隨機分為去卵巢靜止組和去卵巢運動組，每組10只。有3只大鼠在實驗過程中先后死亡，最后納入實驗的動物數見表1。

1.3 運動訓練方案

跑臺運動訓練方案參考我們以前報道并進行適當調整［5］。手術1周后，去卵巢運動組大鼠開始在小動物跑臺上適應訓練 1周，然后進行 18 m/ mim，45 min，坡度5°的正式跑臺訓練，每周4次，正式訓練14周。每周一上午稱所有大鼠體重一次。

1.4 取材

最后一次運動訓練24 h后，按體重腹腔注射水合氯醛麻醉，腹主動脈取血后，游離子宮并在萬分之一天平上稱重，游離雙后肢股骨和脛骨，去盡周圍結締組織，，將左側股骨和脛骨濕紗布包裹后－20℃凍存，而將右側后肢股骨和脛骨用4%多聚甲醛溶液固定，脫鈣后常規石蠟包埋。

1.5 血清E2和骨轉換指標測定

血清E2采用放射免疫方法測定，BGP采用酶標儀測定，TRAP和ALP采用全自動生化分析儀測定，實驗操作完全按照試劑盒說明書。

1.6 骨密度測定

采用雙能x射線骨密度儀的小動物軟件系統分別測量股骨和脛骨近端、中段和遠端三部位骨密度(BMD)和骨礦物含量(BMC)。

1.7 骨組織石蠟切片和HE染色

每組隨機取3只大鼠的股骨遠端和脛骨近端，切取5 μm連續切片。隨機取每只大鼠的3張切片經常規HE染色，在顯微鏡下觀察拍片。

1.8 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件處理數據，實驗結果以均數±標準差(±s)表示，組間差異顯著性采用方差分析的LSD(ANOVA one－way)，P＜0.05被認為差異有顯著性，P ＜0.01被認為差異有極顯著性。

2 結果

2.1 去卵巢手術相關指標

由表1可知，與假手術組比較，去卵巢靜止組大鼠血清E2水平和子宮指數顯著下降;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運動組大鼠血清 E2水平顯著增加，而子宮指數無統計學差異。

2.2 血清骨轉換相關指標

由表2可知，與假手術組比較，去卵巢靜止組大鼠血清ALP和BGP水平顯著增加，TRAP水平顯著下降;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運動組大鼠血清BGP水平顯著增加，ALP和TRAP水平無統計學差異。

2.3 骨量相關指標

由表3可知，與假手術組比較，去卵巢靜止組大鼠股骨近端和遠端的BMD與BMC顯著下降，中段無統計學差異;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運動組股骨各段的BMD與BMC均顯著增加。

表1 各組大鼠血清E2水平和子宮指數的比較Tab.1 Comparison of estrogen content and uterus index in the 3 groups OF RATS

表2 各組大鼠血清骨轉換指標的比較Tab.2 Comparison of bone transformation markers in the 3 groups of rats

表3 各組大鼠股骨骨密度和骨礦物含量的比較Tab.3 Comparison of femur BMD and BMC in all groups of rats

表4 各組大鼠脛骨骨密度和骨礦物含量比較Tab.4 Comparison of tibia BMD and BMC in the 3 groups of rats

由表4可知，與假手術組比較，去卵巢靜止組大鼠脛骨近端的BMD和BMC顯著下降，中段和遠端無統計學差異;與去卵巢靜止組比較，去卵巢運動組大鼠脛骨近端的BMD和BMC顯著增加，中段和遠端無統計學差異。

2.4 骨形態學相關指標

由圖1(見彩插1)可知，假手術組股骨遠端(A)和脛骨近端(B)骨小梁排列完整且緊密，骨髓中有少量的脂肪空泡;去卵巢靜止組股骨遠端(C)和脛骨近端(D)骨小梁斷裂，骨髓中充滿脂肪空泡;去卵巢運動組股骨遠端(E)和脛骨近端(F)骨小梁數目多于去卵巢組，但仍有斷裂，脂肪空泡數目少于去卵巢靜止組。

3 討論

絕經后骨質疏松的病因復雜，雖然目前多數學者認為婦女絕經后 E2水平下降，骨轉換加快，骨吸收大于骨形成是絕經后骨質疏松的主要病因，但其發病機制仍不十分清楚［6］。在骨質疏松的臨床研究中，動物模型的研究不僅可以從組織和細胞水平提供藥物作用機制，還可以從組織和細胞水平評價藥物的療效。1969年 Saville首次用去卵巢大鼠建立絕經后骨質疏松動物模型［7］，后此模型被反復證實能很好地模擬婦女由于絕經引起的骨質疏松臨床癥狀［2，8］。本實驗中，與假手術組比較，去卵巢靜止組大鼠子宮指數、血清E2水平、股骨近端和遠端以及脛骨近端的BMD和BMC均顯著下降，股骨遠端和脛骨近端骨小梁數目減少、間距增大、斷裂增加。不僅表明本實驗的手術成功而且表明絕經后骨質疏松模型也成功復制。

絕經后骨質疏松是可以預防的，而且臨床實踐證明絕經后骨質疏松的預防比治療更重要［3］。眾所周知，運動是一種方便易行的預防絕經后骨質疏松的康復手段。但運動對骨量的調節不僅與運動的方式、頻率、強度有關，而且與運動者的年齡和性別有關［3］。在運動對去卵巢大鼠骨骼影響的研究中，跑臺運動是最為常用的運動方式，相關不同強度跑臺運動對去卵巢大鼠骨影響的研究已表明，中等強度跑臺運動能改善去卵巢大鼠骨質疏松狀態，而持續大強度跑臺運動對骨量的丟失沒有抑制作用［9－11］。本實驗中，去卵巢大鼠經 14周的跑臺運動處理后，股骨和脛骨的BMC和BMD均顯著增加，說明本實驗采用的運動負荷比較合適。為了進一步確定本實驗設定的運動負荷對去卵巢大鼠的療效，我們觀察了運動對去卵巢大鼠股骨遠端和脛骨近端組織形態學的影響。結果表明，去卵巢運動組骨小梁數目多于去卵巢靜止組，骨髓腔中脂肪空泡數目少于去卵巢靜止組，表明本實驗采用的運動負荷能有效改善去卵巢大鼠骨質疏松癥狀。

在評價各種藥物或理療方法對骨質疏松的療效時，測定血清骨轉換指標是一種簡便而又不對患者造成傷害的檢測手段之一。TRAP是常用的反映骨吸收的指標，而ALP和BGP是常用的反映骨形成的指標［12］。就我們查閱文獻所知，目前有關去卵巢后血清 TRAP、ALP和BGP的研究結果報道不一。有結果表明，大鼠去卵巢后，TRAP、ALP和BGP水平均顯著增加;而也有結果表明，大鼠去卵巢后，TRAP、ALP和 BGP水平呈現逐漸下降的趨勢［13－16］。本實驗中，大鼠去卵巢 16周時，血清TRAP活性顯著下降，而ALP活性和BGP含量顯著升高。提示，在去卵巢的晚期(3個月以上)，破骨細胞活動減弱，成骨細胞活動相對較強，骨吸收處于低水平，骨丟失相對平緩。此時單純使用抑制骨吸收的藥物可能對改善骨質疏松的癥狀作用不大，而能促進骨形成的藥物可能有更好的抗骨質疏松作用。

一般認為隨著骨吸收亢進而出現的代償性骨形成增強可引起血清成骨生化指標升高，所以以抑制破骨治療為主時血清成骨生化指標下降，而采用促進成骨法治療時血清骨形成指標升高。Sakakura等人報道［11］，8周跑臺運動能顯著增加去卵巢大鼠血清ALP活性，降低TRAP活性。本實驗中，14周跑臺運動對去卵巢大鼠血清 ALP和TRAP活性沒有影響，但能顯著增加血清BGP含量，提示運動對去卵巢大鼠血清骨轉換指標的影響可能與運動持續的時間有關。血清ALP主要來源于骨和肝臟，只有在排除了肝病和甲抗等疾病的情況下，血ALP才代表成骨細胞的活性［12］。BGP，又稱骨 Gla蛋白，屬非骨膠原蛋白中的一種，血 BGP來源于成骨性細胞譜系，主要由非增殖期成骨細胞分泌入血［12］，可見血清ALP可能沒有BGP特異，這可能是本實驗中，中等強度跑臺運動對去卵巢大鼠晚期血清 ALP和BGP水平影響不一致的原因。

綜上，中等強度跑臺運動可能主要是通過增加血清E2和BGP水平，預防去卵巢大鼠骨質疏松的發生。

［1］ Meczekalski B，Czyzyk A.Conventional hormonal replacement therapy in treatment of osteoporosis［J］.Pol Merkur Lekarski，2009，27(157):72－76.

［2］ Lelovas PP，Xanthos TT，Thoma SE，et al.The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research［J］.Comp Med，2008，58(5):424－430.

［3］ Ishikawa T，Sakuraba K.Biochemical markers of bone turnover. New aspect.Bone metabolism movement in various sports and physical activities［J］.Clin Calcium，2009，19(8):1125－1131.

［4］ 卜淑敏，李亞義，張凡，等.去卵巢大鼠骨髓基質細胞 βcatenin蛋白表達變化觀察［J］.中國骨質疏松雜志，2008，14(8):548－551.

［5］ 張顥，卜淑敏，朱一力，等.跑臺運動對去卵巢大鼠體重和腹腔內脂肪重量以及血清瘦素和脂聯素含量的影響［J］.中國運動醫學雜志，2009，28(2):175－178.

［6］ Lane NE，Yao W.Developments in the scientific understanding of osteoporosis［J］.Arthritis Res Ther，2009，11(3):228.

［7］ Saville PD.Changes in skeletal mass and fragility with castration in the rat:a model of osteoporosis［J］.J Am Geriatr Soc，1969，17(2):155－166.

［8］ Rodgers JB，Faugere M.Animal models for the study of bone loss after cessation of ovarian function［J］.Bone，1993，14:89－94.

［9］ Peng ZQ，V??n?nen HK，Tuukkanen J.Ovariectomy－induced bone loss can be affected by different intensities of treadmillrunning exercise in rats［J］.Calcif Tissue Int，1997，60(5): 441－448.

［10］ Sim?es PA，Zamarioli A，Blóes P，et al.Effect of treadmill exercise on lumbar vertebrae in ovariectomized rats: anthropometrical and mechanical analyses［J］.Acta Bioeng Biomech，2008，10(2):39－41.

［11］ Sakakura Y，Shide N，Tsuruga E，et al.Effects of running exercise on the mandible and tibia of ovariectomized rats［J］.J Bone Miner Metab，2001，19(3):159－167.

［12］ Brown JP，Albert C，Nassar BA et al.Bone turnover markers in the managementofpostmenopausalosteoporosis［J］. Clin Biochem，2009，42:929－942.

［13］ Wang Z，Yang J，Wang G，et al.Influence of Lepidium meyemii walp on lipid and bone mass in ovariectomized rats［J］.Wei Sheng Yan Jiu，2009，38(4):420－422，425.

［14］ Ma J，Yun－guang H，Zhang DH.Effects of acupuncture on bone metabolism and serum estradiol level in ovariectomy－induced osteoporosis rats［J］.Zhen Ci Yan Jiu，2008，33(4):235－239.

［15］ Bae YJ，Kim MH.Manganese supplementation improves mineral density of the spine and femur and serum osteocalcin in rats［J］. Biol Trace Elem Res，2008，124(1):28－34.

［16］ 方玲娜，戴如春，盛志峰，等.血清耐酒石酸性磷酸酶等骨代謝指標在大鼠去卵巢中晚期的變化［J］.中國骨質疏松雜志，2007，13(9):618－620.

Preventive Effects of Moderate Treadmill Exercise on Osteoporosis in Ovariectomized Rats

BO Shu－min，CHEN Yong－jie，HAO Li－ke，WANG Ying－jie
(Capital Institute of Physical Education，Beijing 100088，China)

ObjectiveTo observe the effect of moderate－treadmill exercise on osteoporosis in ovariectomized (OVX)rats。MethodsThirty healthy 3－month old female SD rats were randomly divided into the following three groups: sham－operation(Sham)，orariectomized(OVX)and OVX exercise(EX)groups.The EX group rats did exercise four times per week for 14 weeks according to the following schedule:speed of 18 m/min，45 min time and slope grade of 5°. At the end of experiment，blood was collected from the abdominal vein under anesthesia.The level of serum estrogen (E2)，tartrate－resistant acid phosphatase(TRAP)，alkaline phosphates(ALP)，osteocalcin(BGP)，the femur and tibia bone mineral density(BMD)and bone mineral content(BMC)were detected whereas the morphological change of distal femur and proximal tibia were examined。ResultsThe serum levels of ALP and BGP in OVX group were significantly higher than that of the sham operation group.Compared with the sham operation group，the serum levels of TRAP and E2，the BMD and BMC of proximal and distal femur as well as proximal tibia in the OVX group were significantly decreased. Compared with the OVX group，the serum levels of E2and BGP，the BMD and BMC in three sites of the femur and the proximal tibia were significantly increased。Conclusions Treadmill exercise can increase the serum level of E2and BGP，and has improving effect on bone microstructure in orariectomized rats.

Ovariectomized rats;Exercise;Bone mineral density;Bone mineral content;Bone morphology

G804.7

A

1671－7856(2010)04－0014－05

2009－12－15

國家自然科學基金(30771046);北京市教委科技發展規劃項目(KM200710029001)。

卜淑敏(1967－)，女，博士，教授，研究方向:運動醫學。E－mail:boshumin.163.com。