線性掃描伏安法測定維生素B2

沈崢 習霞 明亮

1 無錫高等師范學校 江蘇無錫 214001 2 南通大學化學化工學院 江蘇南通 226019

1 前言

維生素B2（Vitamine B2，簡寫為VB2），又稱核黃素，化學結構式如圖1所示，它是黃素單核苷酸（FMN）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）的重要組成部分，而FMN和FAD是生物體內的重要輔酶，具有催化生物氧化還原的功能，參與生物體內的許多重要代謝活動 。同時維生素B2也是常用藥物，廣泛用于食品、醫藥和生化等領域。因此，建立靈敏、可靠、簡便的維生素B2測定方法具有重要的實際意義。目前測定維生素B2的方法主要有分光光度法[1]、熒光法[2]以及電化學分析方法[3-4]等。

圖1 維生素B2的化學結構

碳納米管是20世紀90年代初發現的一種具有獨特電學性能、大比表面積、強吸附性及高穩定性的新型碳結構，分單壁碳納米管（SWCNT）和多壁碳納米管（MWCNT）兩類。碳納米管因其優異的性能而成為眾多領域的研究熱點[5-6]。碳納米管用作電極材料可以加速物質的電子交換[7]，因此成為電化學方法的新型材料。本文將多壁碳納米管修飾在玻碳電極上，研究維生素B2在該修飾電極上的電化學行為，發現該修飾電極對維生素B2產生明顯的電催化作用，從而建立一種簡便、快速、靈敏的直接測定維生素B2的電化學分析方法。

2 實驗部分

2.1 主要儀器與試劑

CHI660A型電化學工作站（上海辰華儀器公司），采用三電極體系：多壁碳納米管修飾玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl（飽和KCl溶液）電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。

多壁碳納米管（MWCNT）由南京大學化學化工學院生命分析化學教育部重點實驗室提供，采用催化裂解的方法制備，并按文獻[8]方法進行純化；雙十六烷基磷酸（DHP，瑞士Fluka公司）、維生素B2（生化試劑，上海試劑二廠）、維生素B2片(南京白敬宇制藥有限公司，規格5 mg)，所用化學試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2 MWCNT修飾玻碳電極的制備

將5 mg MWCNT和5 mg DHP加入5 mL二次蒸餾水中，超聲分散20 min直至得到1 mg·mL-1淺黑色的MWCNT-DHP懸浮液。玻碳電極（有效直徑3 mm）依次用0.3、0.05 μm氧化鋁粉及麂皮拋光至鏡面，然后依次在無水乙醇和二次蒸餾水中超聲清洗3 min，紅外燈下烘干。用微量進樣器取MWCNT-DHP懸浮液15 μL滴加在玻碳電極表面，紅外燈下揮發掉溶劑即制得MWCNT修飾玻碳電極。

2.3 分析步驟

MWCNT修飾玻碳電極先在10 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二甲酸氫鉀（pH：4.0）中經循環伏安掃描活化（0.00～-0.80 V），直至循環伏安曲線穩定為止。然后加入一定量的維生素B2標準溶液，通氮氣除氧10 min，在攪拌條件下開路富集3 min后，靜止30 s，用線性掃描伏安法（LSV）進行測定。每次測定后，電極在空白底液中于1.2 V恒電位電解900 s以除去吸附在表面的維生素B2，從而恢復其催化活性。所有實驗均在室溫下進行。

3 結果與討論

3.1 維生素B2在MWCNT修飾電極上的電化學行為

用循環伏安法研究1.0×10-5mol·L-1維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上的電化學行為，其循環伏安曲線如圖2所示。由圖可知，MWCNT修飾玻碳電極在鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中未觀察到任何氧化還原峰（曲線a）。當加入1.0×10-5mol·L-1維生素B2后，在0.00～－0.80 V的陰極掃描過程中，于－0.317 V出現一靈敏度高、峰形較好的還原峰；在反向掃描時，于－0.222 V出現一靈敏度高、峰形較好的氧化峰（曲線b）。而與之形成鮮明對比，維生素B2在裸玻碳電極上未觀察到明顯的氧化還原信號（圖未給出），這是因為MWCNT具有獨特的電化學性質和大比表面積，為維生素B2的氧化還原提供了很多的反應位點，從而使電子交換變得容易，氧化還原峰電流顯著提高。由于維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上的還原峰比氧化峰更為靈敏，因此在接下來的研究中選擇還原峰來定量測定維生素B2。

隨著循環掃描次數的增加，維生素B2的氧化還原峰電流逐漸降低。當以100 mV?s-1的掃速掃描3圈后，氧化還原峰電流趨于穩定，說明反應物或者其反應產物在修飾電極表面發生吸附，使電極表面有效的反應位點降低，從而導致氧化還原峰電流降低。

圖2 MWCNT修飾玻碳電極在pH為4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中的循環伏安曲線

3.2 測定底液的選擇

利用線性掃描伏安法研究1.0×10-5mol·L-1維生素B2在pH值為1.0的鹽酸溶液、pH值為4.0的鄰苯二甲酸氫鉀、pH值為9.2的硼砂溶液、pH值為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖液以及pH值為4.0～6.0的醋酸—醋酸鈉緩沖液（濃度均為0.1 mol·L-1）中的電化學行為。結果表明：在0.1 mol·L-1鄰苯二甲酸氫鉀（pH：4.0）緩沖溶液中，維生素B2的還原峰峰形最好，峰電流最高，因而在實驗中以此電解質作為最佳測定底液。

圖3 1.0×10-5 mol·L-1維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上以不同時間的循環伏安曲線

3.3 修飾劑用量的影響

MWCNT膜能顯著提高維生素B2氧化還原峰電流。但實驗表明，修飾電極表面的MWCNT-DHP復合膜的厚度（由滴加到玻碳電極表面的MWCNT-DHP懸浮液的用量決定）對維生素B2的氧化還原峰電流有很大的影響。當懸浮液用量從0逐漸增加到10 μL時，氧化還原峰電流顯著增加，這是因為隨著電極表面的MWCNT量的逐漸增加，維生素B2在電極表面的富集效率也相應提高，對維生素B2氧化還原的催化活性也隨之增加，最終導致氧化還原峰電流也增加。當用量進一步增加時，氧化還原峰電流變化緩慢，但是當用量超過20 μL時，氧化還原峰電流反而逐漸緩慢降低，這是因為此時電極表面的DHP太多，膜的厚度增大，其絕緣效應降低了MWCNT-DHP復合膜的導電性能，并阻礙了維生素B2的傳質和與電極之間的電子交換，而且揮發溶劑也需要更長的時間。所以本實驗采用15 μL的1 mg·mL-1的MWCNT-DHP懸浮液來制備化學修飾電極。

3.4 富集電位和時間的影響

當富集電位從0.40～－0.40 V時，氧化還原峰電流幾乎不變，這說明富集電位對維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上的電化學氧化過程幾乎沒有影響，所以本實驗選擇開路富集。

在選定的富集電位下考察富集時間變化對維生素B2還原峰電流的影響。結果表明，在富集時間從0增加到3 min的過程中，還原峰電流幾乎線性增加；當超過3 min時，峰電流增加緩慢，進入平臺區，說明此時維生素B2在修飾電極表面吸附達到飽和。本實驗選用3 min的富集時間以提高分析靈敏度及縮短分析時間。

3.5 掃描速度的影響

如圖3所示，在100～300 mV·s-1的掃速范圍內，1.0×10-5mol·L-1維生素B2的氧化還原峰電流與掃描速度存在良好的線性關系，這進一步表明維生素B2在此修飾電極上的電極反應是受吸附控制的。由于隨著掃描速度增大，充電電流必將增大，不利于峰電流的測定。為了獲得較好的信噪比，在獲得較大峰電流的同時又要防止充電電流過大，本實驗最終選用100 mV·s-1的掃描速度。

3.6 線性范圍、檢出限及電極重現性

在上述優化的實驗條件下利用線性掃描伏安法研究維生素B2還原峰電流與濃度的關系。圖4中標準曲線顯示維生素B2的還原峰電流ip（μA）與其濃度C（μmol·L-1）在3.0×10-6～2.0×10-5mol·L-1的范圍內呈現良好的線性關系，其回歸方程為：ip＝－0.652 9＋0.854 8C，（r＝0.999 0）。當濃度高于2.0×10-4mol·L-1時，還原峰電流隨濃度增加而幾乎不變，進一步說明維生素B2在該修飾電極表面發生吸附。開路富集3 min的檢出限為1.0×10-6mol·L-1（按3倍信噪比估算）。每次測定后，將吸附了維生素B2的修飾電極置于pH值為4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖溶液中，于1.2 V恒電位電解900 s后再用二次蒸餾水沖洗。清洗后的修飾電極，維生素B2的吸附峰消失，電極對維生素B2的電催化效果不變。更新的電極表面用于連續測定，在pH為4.0鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液中，對1.0×10-5mol·L-1的維生素B2平行測定10次的相對標準偏差（RSD）為4.2%，說明此修飾電極具有很好的重現性。但是如果將修飾電極在維生素B2溶液中長時間掃描，維生素B2將在電極表面強烈吸附，且電極表面將生成一種聚核黃素膜[9]，這層膜的生成對電極的重現性將有影響。

此外還考察該修飾電極的使用壽命。將電極放置于空氣中72 h再測，峰電流并不顯著下降，表明電極暴露于空氣中亦可保持其催化活性。修飾電極每天測定1次，然后在空白底液中電解于1.2 V恒電位電解900 s活化后存放在冰箱中，4周后對1.0×10-5mol·L-1維生素B2的測定信號僅下降5.8%，這表明該修飾電極具有良好的穩定性和較長的使用壽命。

圖4 維生素B2在MWCNT修飾玻碳電極上的線性伏安曲線（內插圖為標準曲線）

3.7 干擾實驗

在優化實驗條件下，利用線性掃描伏安法研究一些常見的生物小分子及藥劑輔料對測定維生素B2的干擾。實驗表明：500倍的葡萄糖、尿素，100倍的多巴胺、抗壞血酸、撲爾敏、茶堿、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂等，幾乎不干擾1.0×10-5mol·L-1維生素B2的測定（誤差＜3%），人體內常見的各種金屬離子，如Na+、K+、Zn2+、Fe3+、Fe2+等，也不影響維生素B2的測定。

3.8 樣品分析

取市售維生素B2片（標示含量為每片50 mg）10片，研細、稱量。準確稱取相當于1片藥片質量的粉末樣品于100 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解并準確定容，靜置12 h后取100 μL上層清液加入到9.9 mL鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液（pH：4.0）中稀釋待測。在選定的最佳條件下，利用線性掃描伏安法對其進行測定，根據標準曲線線性回歸方程計算出維生素B2含量，同時將該方法與藥典標準方法[1]進行對照實驗，結果見表1。另外，在上述已知維生素B2含量的樣品溶液中，加入1.0×10-5mol·L-1的維生素B2標準溶液，按上述條件進行加標回收實驗，加標回收率在95.8%～103.5%之間。結果表明，此方法測定結果與標示量或藥典標準方法測定結果均相符合，說明該分析方法具有很高的準確性，可用于實際樣品中維生素B2含量的測定。

表1 維生素B2片劑中含量（標示量%）測定結果

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