一株葡萄酒Pichia sp.菌的分離鑒定及其產香成分分析

肖 陽，孫寶國，廖永紅，沈 晗，石文娟，任文雅

(北京工商大學化學與環境工程學院，北京100048)

一株葡萄酒Pichia sp.菌的分離鑒定及其產香成分分析

肖 陽，孫寶國，廖永紅*，沈 晗，石文娟，任文雅

(北京工商大學化學與環境工程學院，北京100048)

從葡萄酒泥中分離得到一株產香能力強的酵母菌株，經Biolog鑒定為Pichia sp.菌種，其對數生長期較短，210h內細胞穩定性良好，能利用麥芽糖、麥芽三糖、棉子糖、蔗糖等8種碳源;菌種發酵產香為酯香，經GC－MS分析可知，其香味成分主要為乙酸乙酯、乙醇、4－羥基－2－丁酮、苯甲醛等。

葡萄酒泥，產香酵母，Biolog，GC－MS

Abstract:A yeast separated from the grape wine mud had strong aroma－producing abilities.The result of the Biolog system identification showed that the yeast belongs to Pichia sp.The yeast had a short exponential phase and good stabilities in 210h.8 kinds of carbon sources such as Maltose，Maltotriose，Raffinose，Sucrose and so on could be utilized.Analyzed by GC－MS，the fermentation flavors come from esters including ethyl acetate，ethanol，4－－OH－2－ butanone，benzaldehyde and so on.

Key words:grape wine mud;ester－producing yeasts;Biolog;GC－MS

產香酵母在葡萄酒釀造中有著非常重要的作用，這些酵母主要分布于果皮表面、園區土壤、自然發酵醪液以及酒廠等環境中［1］，它們能代謝產生多種酶，如β－糖苷酶、蛋白酶、酯酶等，這些酶酶解葡萄汁中的各種營養成分，產生不同的風味物質，從而賦予葡萄酒特有的香氣［2－3］。酵母菌的分類鑒定方法有很多種，其中Biolog微生物自動分析系統鑒定是根據酵母菌對糖、醇、酸、酯等多種碳源的利用情況來快速鑒定出酵母菌的種屬，較傳統的形態學鑒定及分子生物學鑒定更快速、簡便［4］。利用動、靜態頂隙色譜法、高效液相色譜和GC－MS等法對酵母發酵產生的香氣成分進行分析，能夠為酵母發酵產香的廣泛應用提供有力依據［5］。本實驗通過Biolog微生物系統對葡萄酒泥樣品中分離純化得到的一株產香酵母菌進行鑒定，并利用GC－MS對其發酵產香成分進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒泥，YPD培養基，豆芽汁培養基。

滅菌鍋，LRH－250型生化培養箱，130S超凈工作臺，Biolog微生物自動鑒定儀，GC，GC－MS，紫外分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化 取葡萄酒泥5g，加入100mL無菌生理鹽水，浸泡15min后搖勻，取上清液0.1mL逐級稀釋到10－6，取各梯度稀釋液于YPD培養基平板稀釋涂布，28℃培養48h后，挑取酵母菌落特征的單菌落，制成不同濃度菌懸液，再度稀釋涂布，重復3～4次，直至獲得純菌種，用YPD斜面劃線保藏。

1.2.2 酵母產香能力比較 無菌操作下取活化酵母菌懸液1mL，接種入20mL豆芽汁培養基的試管中，28℃靜置培養48h后感官評定［6］，5項評定指標分為10個等級，10名評定人員按標準方法評分，記錄并統計分值。感官評定指標項目及分級見表1。

1.2.3 產香酵母Biolog系統鑒定［7］將純化好的產香能力強的待測菌株，嚴格按Biolog鑒定要求的操作規程進行菌株鑒定。

表1 產香感官評定標準

1.2.4 產香酵母生長曲線的測定［8］按5%接種量將酵母菌接入250mL豆芽汁培養基中，28℃振蕩培養，每隔3h測定酵母細胞濃度的OD600值，以時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制生長曲線。

1.2.5 產香酵母的碳源利用分析 Biolog系統鑒定用的96微孔板，共提供了67種碳源，根據每孔顯色反應數值大小即可分析出酵母菌的碳源利用情況。

1.2.6 發酵產香成分的GC－MS及GC分析［9－10］活化酵母菌懸液0.5mL接入9.5mL豆芽汁液體培養基中(平行做7支試管)，28℃靜置發酵，每隔24h取1支進行GC－MS或GC分析。先采用頂空固相微萃取法對發酵完樣品進行預處理，其條件為CAR/PDMS 75μm Black萃取頭將發酵液 10mL于 50℃萃取20min;后續GC條件為采用VF－5ms 30m×0.25mm×0.25μm毛細管柱，進樣口溫度250℃，起始溫度35℃，保留1min，以5℃/min升至260℃，保留3min;MS條件為離子源230℃，接口230℃，電離方式EI，電離電壓 70eV，檢測器電壓 0.96kV，掃描范圍29～350m/z，掃描方式Scan。收集各峰進行數據庫檢索即可得香氣成分物質名稱及含量，將各時間段的發酵樣品進行GC分析即可得目標物質含量隨時間的變化。

2 結果與討論

2.1 酵母菌分離與純化

將葡萄酒泥樣按1.2.1的方法進行菌種分離，得到7株不同菌落特征的酵母菌株，分別編號1#～7#，劃線低溫保藏。

2.2 產香酵母的篩選

對分離出的7株菌株按1.2.2的方法進行產香能力比較，挑選得分最高的菌株并標記為CX－1，其細胞形態近圓形，無出芽，在平板培養時菌落近圓形、白色、凸起明顯、較為粘稠，而在液體培養時產生較多沉淀，無菌璞。

2.3 產香酵母Biolog系統鑒定

按Biolog系統鑒定操作要求對CX－1進行鑒定，結果為Pichia sp.(畢赤氏酵母屬)，其培養24h時的相似度達0.679，鑒定結果準確。Pichia sp.在葡萄酒發酵中期，即酒精含量達到3%～4%時占優勢，對葡萄酒釀造有重要作用。相關研究可知，Pichia sp.還能利用甘油發酵產1，3－二羥基丙酮［11］，能利用紅橡木酸水解物發酵產乙醇［12］，同時也是真核基因表達系統構建常見的一種菌種［13］，但關于Pichia sp.的生長代謝及其發酵產香的系統研究未見報道。

2.4 產香酵母的發酵產香性能的初步研究

2.4.1 產香酵母的生長曲線 細胞的生長性能是工業發酵利用微生物的重要指標，按1.2.4的方法對Pichia sp.菌種進行生長曲線及培養液pH的測定，見圖1。

圖1 產香酵母的生長曲線及pH變化曲線

從圖1可知，Pichia sp.菌種生長的停滯期較短，在12h左右進入對數生長期，在24h左右進入穩定期，且細胞濃度在所測試的168h內一直維持穩定，說明Pichia sp.菌種適應性良好，具有較強的生長繁殖能力，且細胞穩定性好，不易發生衰亡和自溶，可以進行工業產香發酵研究。

Pichia sp.菌種的生長代謝產物使得培養液的pH也隨著發生改變，穩定期之前，pH下降較快，進入穩定期之后pH變化不明顯。

2.4.2 產香酵母的碳源利用 Biolog鑒定用的96微孔板中含有67種不同的碳源，菌種利用這些碳源進行生長代謝的時候會產生不同的顯色反應，根據顯色反應數值的大小即可判斷出酵母的碳源利用情況。圖2顯示了Pichia sp.菌種在不同時刻對這些碳源的利用情況。

圖2 Pichia sp．不同時刻的碳源利用

從圖2可知，Pichia sp.菌種能利用8種碳源，對不同的碳源其利用率也各異，其中利用率最高是蔗糖，其次是α－D－葡萄糖;同一碳源在不同時間的利用率大小也各異，蔗糖、α－D－葡萄糖、松二糖、麥芽糖和棉子糖在24h時利用最大，而其他3種碳源則在48h達到最大;由于棉子糖會導致在甜菜制糖工藝中蔗糖結晶難以析出而產生大量的廢糖蜜［14］，從資源利用角度出發，可以利用Pichia sp.菌種先行降解棉子糖，從而加速蔗糖的結晶析出，減少廢糖蜜產生。

2.4.3 發酵產香成分分析 產香酵母在發酵時代謝產生多種物質，如醇類、酯類、酮類、醛類等，這些物質含量各異且具有不同的香氣特征，從而構成了酵母菌特有的發酵香氣，按1.2.6的方法對Pichia sp.菌種的發酵香氣成分進行GC－MS分析，得GC－MS譜圖見圖3，檢索各峰物質名稱及峰面積見表2。

表2 Pichia sp.菌種發酵香氣成分名稱及含量

圖3 Pichia sp.菌種發酵香氣成分的GC/MS譜圖

從表2可知，Pichia sp.菌種發酵香氣總體呈現為酯香，其香氣成分主要為乙酸乙酯、乙醇、4－羥基－2－丁酮、苯甲醛。其中乙酸乙酯具有柔和的果香和奶油味，并已用作仿造奶油、葡萄和草莓的香氣物質［15］;4－羥基－2－丁酮具有愉快的牛奶香味、甜香味等;苯甲醛具有苦杏仁味，具有導致氣味加成或協同作用的效果，是非常有效的風味修飾劑［16］，由此可見，葡萄酒曲中的Pichia sp.菌種對葡萄酒釀造過程中所形成的特征香氣是很重要的。

取不同時段的發酵液按1.2.6的方法進行GC分析，即可得到Pichia sp.菌種發酵香氣主要成分含量變化，見圖4。

圖4 Pichia sp.菌種發酵主要香氣成分含量變化

從圖4可知，由于菌種在對數生長期生長代謝旺盛，Pichia sp.菌利用發酵液中的氨基酸，通過脫氨、脫羧、還原、縮合作用大量生成醇類、醛類、酮類、酯類等物質，主要發酵香氣物質在這此期間(0～24h)大量產生。進入穩定期(24h以后)各風味物質含量相對穩定，其中乙酸乙酯的含量稍有增多，而乙醇的含量逐漸略有減少，這是因為穩定期的pH較低，有利于醇類物質在一定程度上向酯類物質的轉化(酸類+醇類?酯類)，但4－羥基－2－丁酮及苯甲醛則基本保持不變。

3 結論

從葡萄酒泥樣品中分離得到一株產香能力強的Pichia sp.菌種，它適應性良好，具有較短的對數生長期且穩定性良好，能夠利用蔗糖、α－D－葡萄糖、松二糖等8種碳源，其中對蔗糖的利用率最高。

Pichia sp.菌種發酵產香的香型主體為酯香，主要含有乙酸乙酯、乙醇、4－羥基－2－丁酮、苯甲醛等香氣成分，這些物質主要在對數生長期大量產生，進入穩定期后，乙醇含量略有減少，乙酸乙酯含量稍增，其他物質含量基本不變。

我國葡萄酒生產主要依靠活性干酵母進行發酵，不僅使產品的同質化效應加劇，同時也抑制自然界中釀酒酵母及其它野生酵母的進化發展，大自然的寶貴資源沒有充分利用。近年來，國外已經越來越重視非釀酒酵母和野生酵母對葡萄酒的作用。加強葡萄酒酵母的篩選及其發酵產香特性的研究，對我國葡萄酒的發展具有十分重要的意義。

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Identification and aroma components analysis of Pichia sp.yeast separated from grape wine mud

XIAO Yang，SUN Bao－guo，LIAO Yong－hong*，SHEN Han，SHI Wen－juan，REN Wen－ya
(Institute of the Chemical and Environmental Engineering，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China)

TS262.6

A

1002－0306(2010)08－0164－04

2009－02－22 *通訊聯系人

肖陽(1967－)，男，本科，實驗師，研究方向:風味食品應用化學。

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAK36B05)。