不同基因型煙草品種接種赤星病菌后抗病蛋白的變化研究

曹祥煉，宋彥君，程海峰，豆顯武，楊鐵釗

(1.湖北省襄樊市煙草公司 保康煙葉分公司，湖北 保康 441600;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002)

煙草赤星病是由鏈格孢菌［Ternaria alternata(Fries)Keissler］引致的煙葉成熟后期重要的葉部真菌性病害，嚴(yán)重影響著煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著煙草生產(chǎn)的發(fā)展。赤星病在世界各煙草產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，是煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一。赤星病具有潛育期短、流行速度快的特點(diǎn)，在環(huán)境條件有利于發(fā)病的情況下，短時(shí)間內(nèi)即可造成大的流行，給煙葉生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失［1］。煙草赤星病1892年首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)，曾幾次給世界煙葉生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。1916年我國(guó)在北京附近首次發(fā)現(xiàn)，1964年在山東煙區(qū)流行，隨后全國(guó)各煙區(qū)有日益嚴(yán)重的趨勢(shì)。1989至1991年3年間，河南省平均每年因赤星病造成的損失達(dá)人民幣2 300萬(wàn)元［3］，成為毀滅性的病害。2000年8月初在美國(guó)的康乃狄克州和麻薩諸塞州，煙草赤星病大爆發(fā)，分別減產(chǎn)至少達(dá)75% 和89%［4］。

植物受到病原真菌侵染時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的主動(dòng)防御反應(yīng)。這些反應(yīng)包括:合成植保素，感染區(qū)域細(xì)胞結(jié)構(gòu)的加厚與增強(qiáng)，病程相關(guān)蛋白 (PR蛋白)的誘導(dǎo)和積累。這些反應(yīng)還參與了防衛(wèi)反應(yīng)中的信號(hào)傳遞，使植物獲得系統(tǒng)性抗性［5－6］。

病程相關(guān)蛋白中研究較多的是幾丁質(zhì)酶(Glu)和β-1，3-葡聚糖酶 (Cht)。很多植物病原真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)和葡聚糖，體外抑菌試驗(yàn)表明，它們能抑制一些病原真菌孢子的萌發(fā)和病菌生長(zhǎng)，因此幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶一直被看作是植物抗真菌病害的潛在物質(zhì)［5］。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與種植

供試煙草品種為感赤星病品種長(zhǎng)脖黃和高抗赤星病突變體凈葉黃，豫煙4號(hào)作感病對(duì)照，煙草品種來(lái)自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)。種子、植煙土壤經(jīng)過(guò)嚴(yán)格消毒，采用盆栽種植。3個(gè)品種分別于2008年5月10號(hào)移栽，重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列，正常管理。

1.2 菌種與培養(yǎng)

孢子懸浮液。

1.3 接種與取樣

從煙草苗下部起選第3到第4片成熟葉片，噴霧接種，每個(gè)小區(qū)的各品種處理一致。接種后人工保溫30℃并保濕培養(yǎng)，分別于接種前0 h，接種后12，24，36和48 h取樣。以同生育期同部位成熟葉片噴施清水做空白對(duì)照。

田間采集到的赤星病菌強(qiáng)毒株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌水洗下，配制成孢子濃度為106個(gè)·mL－1的孢子懸浮液。

1.4 測(cè)定方法

幾丁質(zhì)酶活性的測(cè)定參照 Boller等［7］的方法。β-1，3-葡聚糖酶活性的測(cè)定參照史益敏［8］的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 幾丁質(zhì)酶活性

幾丁質(zhì)是許多真菌細(xì)胞壁、昆蟲體壁和甲殼類動(dòng)物中的主要結(jié)構(gòu)成分，但在高等植物中尚未發(fā)現(xiàn)有幾丁質(zhì)的存在。當(dāng)植物受到病原物侵染時(shí)體內(nèi)會(huì)積累病程相關(guān)蛋白 (pathogenesis-relatedprotein，PR)，已證明部分PR是幾丁質(zhì)酶［10］。很多研究表明，幾丁質(zhì)酶在參與寄主植物和病原菌之間相互作用有2個(gè)方面，即幾丁質(zhì)酶有潛在的抗菌特性的直接作用和通過(guò)釋放幾丁質(zhì)寡聚物而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的間接作用［11］。現(xiàn)已有大量的試驗(yàn)證實(shí)，植物幾丁質(zhì)酶是可以被誘導(dǎo)的，大多數(shù)高等植物體內(nèi)所含的幾丁質(zhì)基因表達(dá)水平很低或不表達(dá)，而在受到如病原菌侵染、外源幾丁質(zhì)、殼聚糖、水楊酸和乙烯等因子作用時(shí)均能被誘導(dǎo)表達(dá)［12］。

測(cè)定不同基因型的煙草品種接種赤星病菌后在正常生長(zhǎng)條件下其葉片內(nèi)幾丁質(zhì)酶的基礎(chǔ)活性，結(jié)果如圖1所示:抗病品種凈葉黃幾丁質(zhì)酶總活性的平均值為7個(gè)活力單位 (U)，感病品種長(zhǎng)脖黃為3個(gè)活力單位，而另一感病品種豫煙4號(hào)的幾丁質(zhì)酶的基礎(chǔ)活性為4個(gè)活力單位左右。由此可見在正常生長(zhǎng)條件下，抗病品種凈葉黃比感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)活性高。

圖1 抗性煙草品種未接種幾丁質(zhì)酶的變化

從圖2－4可以看出，無(wú)論是抗病品種還是感病品種，接種赤星病菌后幾丁質(zhì)酶含量與其基礎(chǔ)含量相比都呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。3個(gè)品種在接種赤星病菌后的前12 h幾丁質(zhì)酶活性均上升較慢，凈葉黃在接種后12～24 h幾丁質(zhì)酶含量達(dá)到10.06個(gè)活力單位，此后幾丁質(zhì)酶活性仍一直上升，但升高速度減慢。感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)幾丁質(zhì)酶活性變化規(guī)律基本一致，在接種赤星病菌后48 h內(nèi)酶活性呈上升趨勢(shì)。幾丁質(zhì)酶潛在的抗菌特性的直接作用導(dǎo)致酶活性在接種前期劇烈上升，之后通過(guò)釋放幾丁質(zhì)寡聚物而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性的間接作用，從而導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶活性的在接菌后的48 h內(nèi)一直上升。從圖5可以看出，不同抗性煙草品種在接種赤星病菌后的前12 h，抗病品種凈葉黃幾丁質(zhì)酶活性上升速度比感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)要快，且在整個(gè)過(guò)程中凈葉黃的幾丁質(zhì)酶活性都比長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)要高，這可能是凈葉黃抗赤星病的原因。

圖2 凈葉黃接種后幾丁質(zhì)酶的變化

圖3 長(zhǎng)脖黃接種后幾丁質(zhì)酶的變化

圖4 豫煙4號(hào)接種后幾丁質(zhì)酶的變化

圖5 抗性煙草品種接種后幾丁質(zhì)酶的變化

2.2 β-1，3-葡聚糖酶活性

測(cè)定不同基因型的煙草品種接種赤星病菌后，在正常生長(zhǎng)條件下其葉片內(nèi)β-1，3-葡聚糖酶的基礎(chǔ)活性，結(jié)果如圖6所示:不同基因型煙草品種β-1，3-葡聚糖酶活性變化與幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)活性變化基本一致，都表現(xiàn)為長(zhǎng)脖黃酶基礎(chǔ)活性最低，凈葉黃基礎(chǔ)活性最高，豫煙4號(hào)居中。抗病品種凈葉黃在正常生長(zhǎng)條件其β-1，3-葡聚糖酶基礎(chǔ)活性的平均值為1 950個(gè)活力單位，感病品種長(zhǎng)脖黃基礎(chǔ)活性為1 700個(gè)活力單位，而另一感病品種豫煙4號(hào)為1 850個(gè)活力單位上下。由此可見在正常生長(zhǎng)條件下，抗性品種凈葉黃比感病品種長(zhǎng)脖黃體和豫煙4號(hào)體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的活性高。

圖6 抗性煙草品種β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

測(cè)定不同品種在接種赤星病菌后β-1，3-葡聚糖酶酶活性的變化，結(jié)果如圖7－9所示，無(wú)論是抗病品種還是感病品種，接種赤星病菌后β-1，3-葡聚糖酶含量與其基礎(chǔ)含量相比都呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。凈葉黃在接菌后12 h內(nèi) β-1，3-葡聚糖酶達(dá)到2 272.4個(gè)活力單位，此后 β-1，3-葡聚糖酶活性仍一直上升，但升高速度減慢。這可能與葡聚糖在細(xì)胞壁內(nèi)部外部均存在有關(guān)。感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)β-1，3-葡聚糖酶活性變化規(guī)律基本一致，在接種赤星病菌48 h內(nèi)酶活性呈上升趨勢(shì)。從圖10可以看出，不同抗性煙草品種在接種赤星病菌后的前12 h，抗病品種凈葉黃β-1，3-葡聚糖酶活性上升速度比感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)要快，而感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)在接種后12～24 h β-1，3-葡聚糖酶酶活性上升較快，但比抗病品種晚12 h。在整個(gè)過(guò)程中凈葉黃的β-1，3-葡聚糖酶活性都比長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)要高，這可能是凈葉黃抗赤星病的原因。

圖7 凈葉黃接種后β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

圖8 長(zhǎng)脖黃接種β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

圖9 豫煙4號(hào)接種β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

圖10 不同抗性品種β-1，3-葡聚糖酶活性的變化

2.3 幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性變化趨勢(shì)

從圖11可以看出，凈葉黃在接菌后 β-1，3-葡聚糖酶變化比較平穩(wěn)，幾丁質(zhì)酶在接菌后12 h劇烈上升，24～48 h緩慢上升;感病品種長(zhǎng)脖黃在接菌后，β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性變化趨勢(shì)基本一致，在整個(gè)過(guò)程中一直呈上升趨勢(shì)，幾丁質(zhì)酶在24～36 h劇烈上升，在36 h上升緩慢 (圖12);豫煙4號(hào) β-1，3-葡聚糖酶活性在12～36 h上升明顯，幾丁質(zhì)酶酶活性在24～36 h明顯增強(qiáng)(圖13)。從時(shí)間上看感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)幾丁質(zhì)酶酶活性劇烈上升比抗病品種凈葉黃晚12 h。3個(gè)品種在接菌后幾丁質(zhì)酶和 β-1，3-葡聚糖酶酶活性均表現(xiàn)一定的相似性，幾丁質(zhì)酶酶活性劇烈上升時(shí)間比β-1，3-葡聚糖酶晚。分析認(rèn)為，可能與β-1，3-葡聚糖在病菌細(xì)胞壁內(nèi)部外部都存在，而幾丁質(zhì)主要存在與病菌的細(xì)胞壁內(nèi)部有關(guān)。

圖11 凈葉黃接種后幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶酶活性的變化

圖12 長(zhǎng)脖黃接種后幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶酶活性的變化

圖13 豫煙4號(hào)接種后幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶酶活性的變化

3 小結(jié)與討論

幾丁質(zhì)和β-1，3-葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)成分 ，在許多真菌的菌絲頂端 ，β-1，3-葡聚糖和幾丁質(zhì)暴露在細(xì)胞壁表面 ，能夠直接受到β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶的水解［14］，這不僅使真菌菌絲生長(zhǎng)點(diǎn)受到破壞 ，而且在水解過(guò)程中由真菌細(xì)胞壁釋放出來(lái)的寡糖能夠作為植物多種抗病反應(yīng)的激發(fā)因子 ，誘導(dǎo)植物的全面防衛(wèi)反應(yīng)［14］。在正常生長(zhǎng)條件下，抗病品種凈葉黃比感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)體內(nèi)幾丁質(zhì)酶基礎(chǔ)活性高，接種赤星病菌后抗病品種凈葉黃幾丁質(zhì)酶活性上升速度比感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)要快。凈葉黃在接種后12 h幾丁質(zhì)酶活性迅速升高，在之后的24 h幾丁質(zhì)酶活性又一次劇烈上升。可能由于凈葉黃在赤星病菌接種初期，直接攻擊病原物真菌的細(xì)胞壁，使病原菌瓦解失去致病力，同時(shí)酶解后病原菌的細(xì)胞壁破碎物又可作為激發(fā)子再次刺激植物產(chǎn)生抗病防衛(wèi)反應(yīng)，導(dǎo)致酶活性又一次升高，從而達(dá)到抗病的目的。

在接種后的整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)的幾丁質(zhì)酶活性與其對(duì)照相比都有不明顯的提高，但比凈葉黃的要低得多。分析認(rèn)為赤星病菌侵染感病品種長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)后，由于煙草體內(nèi)被誘導(dǎo)的幾丁質(zhì)酶的活性很低，抵抗和殺死病菌的能力差，是導(dǎo)致感病品種發(fā)病的原因之一。

無(wú)論是抗病品種還是感病品種，接種赤星病菌后β-1，3-葡聚糖酶含量與其基礎(chǔ)含量比都有明顯的上升。推斷由于接種后，隨著赤星病菌的入侵，煙草啟動(dòng)體內(nèi)有關(guān)的抗病防衛(wèi)機(jī)制，相關(guān)抗病蛋白酶被激活。由于β-1，3-葡聚糖酶直接作用于赤星病菌的細(xì)胞壁，因此酶活性的升高對(duì)赤星病菌起到抑制作用。凈葉黃的β-1，3-葡聚糖酶的積累不管是在量上還是在時(shí)間上都比長(zhǎng)脖黃和豫煙4號(hào)要快，對(duì)于病原菌的入侵凈葉黃反應(yīng)較迅速，能及時(shí)抑制病原菌，阻止病害進(jìn)一步擴(kuò)展。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，3個(gè)品種幾丁質(zhì)酶積累時(shí)間與β-1，3-葡聚糖酶積累時(shí)間相比具有一定滯后性，可能與葡聚糖在真菌細(xì)胞壁內(nèi)外都有，而幾丁質(zhì)主要存在于細(xì)胞壁內(nèi)部有關(guān)。

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