裂殖壺菌發酵生產DHA研究進展

魏 萍，馬小琛，任路靜，紀曉俊，何光華，劉 臻，黃 和，*

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京210009；2.浙江貝因美科工貿股份有限公司，浙江杭州310007）

裂殖壺菌發酵生產DHA研究進展

魏 萍1，馬小琛1，任路靜1，紀曉俊1，何光華2，劉 臻2，黃 和1，*

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，材料化學工程國家重點實驗室，江蘇南京210009；2.浙江貝因美科工貿股份有限公司，浙江杭州310007）

DHA是一種重要的多不飽和脂肪酸，裂殖壺菌（Schizochytrium）因富含DHA成為當前國內外研究熱點。本文介紹了Schizochytrium及其合成DHA的代謝機理，并對國內外Schizochytrium發酵生產DHA的水平、發酵底物、發酵工藝進行綜述?；谀壳鞍l酵狀況，提出了DHA發酵過程中存在的問題，并指出選育高產穩定菌株、對合成DHA代謝途徑及關鍵酶進行研究、改進合適的生物反應器并進一步應用數學工具優化發酵工藝是今后的研究重點。

裂殖壺菌，DHA，發酵

Abstract：DHA is an important polyunsaturated fatty acid.Schizochytrium has captured an international research hotspot because of its abundant content of DHA.In this article，Schizochytrium and its metabolic mechanism for DHA biosynthesis，the production level，fermentation substrates and fermentation technology were introduced.In view of the present research situation，the problems existed in DHA fermentation process were also mentioned.It is pointed out that the future research emphasis should be placed on screening high-yield and stable microbe strains，investigating the key enzymes involved in the lipid biosynthesis，designing an appropriate bioreactor for DHA production and using the mathematic tools to optimize the fermentation process.

Key words：Schizochytrium；DHA；fermentation

二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，簡稱DHA）是重要的ω-3多不飽和脂肪酸，俗稱“腦黃金”，具有促進腦細胞生長發育、降血脂、降血糖、保護視力、抗癌及提高免疫能力等多種重要的生理功能，被譽為新一代功能保健因子，受到世人極大的關注。傳統深海魚油提取的DHA受魚的品種、季節及地理位置的影響而不穩定，且膽固醇和其它不飽和脂肪酸含量高，導致DHA產量有限、分離純化困難，成本較高等問題。隨著魚油原料來源日漸緊缺，難以實現DHA這種高附加值產品在食品和醫藥等行業中的廣泛應用。微生物發酵法生產DHA可克服傳統魚油提取的不足，可用于大量生產DHA，不斷滿足人們的需求，具有廣闊的應用前景，備受國內外學者關注。能夠合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和微藻，如破囊壺菌（Thraustochytrium）、裂殖壺菌（Schizochytrium）、隱甲藻（Crythecodinium cohnii）等。而Schizochytrium因其生長速度快、易于培養、細胞內脂肪酸和DHA含量高等優勢，具有更大的應用價值，是目前進行工業化生產DHA的理想物種之一［1］。

1 裂殖壺菌概述

1.1 裂殖壺菌介紹

Schizochytrium又稱裂壺藻，屬于真菌門（Eumycota）、卵菌綱（ Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、破囊壺菌科（Thraustochytriaceae）的一類類藻的海洋真菌，單細胞、球形。目前已有五個種被分離出，分別是：S.aggregatum、S.minutum、S.octosporum、 S.mangrovei 和 S.limacinum。Schizochytrium細胞積累大量對人體有用的活性物質，如：油脂、色素（類胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素等）、角鯊烯［2］等，其中油脂占細胞干重的70%以上，總脂肪酸中DHA的質量分數高達35%～45%，且細胞中90%以上的油脂以人體易吸收的中性油脂——甘油三酯（TG）形式存在，還有的是以卵磷脂（PC）形式存在，如 1-棕櫚-2-DHA-PC 和 1，2-雙-DHA-PC［3］。

表1 國內外代表機構用Schizochytrium發酵產DHA水平概況

對于Schizochytrium的安全性評價，Hammond等人進行了全面、詳細的研究，包括對大鼠的亞急性毒性實驗［4］、對大鼠和兔子發育的毒性實驗［5］、對大鼠生殖影響的實驗［6］、對大鼠的誘變實驗［7］以及對豬發育的安全性評價［8］，均未發現有任何毒副作用。且其安全性已得到美國食品藥品管理局局（Food and Drug Administration）的認可，能開發醫藥、食品（尤其是孕婦、哺乳期婦女和兒童食品）以及飼料等系列產品。美國已經批準Schizochytrium為GRAS（Generally Recognised as safe）級營養添加物，推薦的每日攝入量為1.5g。

1.2 裂殖壺菌合成DHA代謝機理

在生物體內，長鏈多不飽和脂肪酸的合成是一個碳鏈延長和耗能的過程，需要物質乙酰-CoA、不同種類的酶和NADPH提供的能量。其中乙酰-CoA不能直接穿出線粒體膜，主要通過胞漿中的檸檬酸轉運體系到達胞漿，經檸檬酸裂解酶得到乙酰CoA和草酰乙酸。草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶和蘋果酸脫梭酶的作用下，產生NADPH提供脂肪酸合成中所需要的還原力，產生的乙酰-CoA作為脂肪酸合成的起始物質。在乙酰CoA和NADPH充足供應的基礎上，長鏈多不飽和脂肪酸是如何合成的呢？絕大多數的微生物體內多不飽和脂肪酸通常由單不飽和脂肪酸和脂肪酸油酸開始，并通過脂肪酸合成酶（FAS）和一系列去飽和酶催化完成。近年來，許多研究者發現Schizochytrium合成DHA存在新的途徑。Metz［9］等通過對Schizochytrium sp.ATCC20888多不飽和脂肪酸合成酶3個亞基的開放閱讀框對比分析以及14C同位素標記推斷：Schizochytrium極有可能通過聚酮合酶（PKS）催 化 合 成 DHA。Wallis［10］等 人 也 揭 示Schizochytrium體內DHA生物合成不依賴碳鏈延長與脫氫反應，他們的研究成果進一步揭示了DHA合成存在新的機制。2003年，Martek公司成功攻克了Schizochytrium中編碼PKS途徑中相關酶的基因序列［11］，并于2006 年對 Schizochytrium sp.中長鏈多不飽和脂肪酸合成酶以及I型的脂肪酸合成酶進行研究，提出在Schizochytrium sp.體中DHA和DPA只需由長鏈多不飽和脂肪酸合成酶合成，而短鏈的飽和脂肪酸（C14∶0和 C16∶0）主要通過 I 型的脂肪酸合成酶合成［12］。以上研究充分說明，Schizochytrium體內DHA的合成過程并不涉及脂肪酸脫氫酶和去飽和酶催化過程，而是由PKS途徑合成。這一重要發現將為Schizochytrium產DHA的代謝調控研究提供新的思路和方法。但是對于DHA的具體合成機理仍不清楚，有待進一步研究。

2 裂殖壺菌發酵DHA研究水平概述

八十年代初隨著人們對PUFAs生理作用認識的加強，DHA的生物合成引起了人們的極大關注。國外對發酵產DHA的研究較早，且DHA的生產在日本和一些歐美國家已進入工業化生產階段。最早將Schizochytrium應用于商業化生產的是美國的Omega生物技術公司。早在1991年，該公司就研究出了一套Schizochytrium的培養工藝，培養48h后，菌體的生物量可達20g/L，DHA達細胞干重的10%［13］。10多年前，Martek生物科技收購了Omega生物技術公司，并已成功篩選出異養培養生產富含DHA的菌種，并在培養條件上進行了深入探索，將DHA產量提升到40～45g/L［14］，并奠定了該公司在 DHA 生產市場的主導地位。近年來國內一些科研機構如廈門大學、浙江大學、南京工業大學等對 Schizochytrium發酵產DHA進行研究，見表1，并取得一定進展，但產量和質量均較國外尚有一定差距，導致很多化妝品及食品行業仍需要進口的微膠囊DHA。

3 發酵底物

Schizochytrium生長需要提供足夠的碳源和氮源。碳源和氮源的數量和來源對其合成DHA有重要的影響，見表2。Wu［23］等發現葡萄糖、果糖和甘油DHA生產是較適的碳源，而二糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、多糖和可溶性淀粉都適合Schizochytrium sp.S31細胞的生長和脂質的積累，但不適合DHA的生產。Schizochytrium較多地利用有機氮源，如酵母抽提液、谷氨酸、胰胨、玉米漿等，但 Nakaharal［24］發現，無機氮源（NH4）2SO4是玉米漿良好的替代源，且可以用來調節培養基的pH。Ganuza［16］等采用分批發酵，在培養基中不斷通入NH3，該通入的NH3不僅使培養保持一定pH，還可以作為氮源，最終DHA含量高達15.75g/L。在所有底物中，葡萄糖和酵母提取液是最常用的碳源和有機氮源。近年來研究者開始利用一些廢料或粗糧作為底物，以期望達到廢物再利用、節約糧食和降低成本，如Chi［25］等利用生物柴油副產物甘油作為Schizochytrium limacinum的原料發酵產DHA，其生物量達22.1g/L，DHA產量達4.91g/L，結果表明，生物柴油副產物甘油是Schizochytrium生產DHA很好的原料。Yamasaki［26］等利用酒廠廢水作為原料，DHA的產量達3.4g/L。以上研究充分說明，Schizochytrium能利用廉價廢棄生物質資源發酵生產DHA。雖然Schizochytrium使用有些底物時，DHA的產量并不高［30］，但為工業降低成本提供了新的研究思路和方向。

表2 不同發酵底物對Schizochytrium生產DHA的研究

4 發酵工藝

4.1 兩步發酵法

Schizochytrium培養分為細胞生長/分裂階段和脂質積累階段，學者們采用兩步發酵法即采用分批發酵培養和培養條件改變，從而實現其高密度發酵和油脂在體內的大量積累。在細胞生長/分裂階段需要提供足夠的營養以滿足細胞生長繁殖的蛋白質、核苷等的合成。氮源的限制是油脂合成啟動的前提［30］，因此油脂積累階段應適當限制氮源。Schizochytrium是需氧異養微生物，但DHA是通過厭氧途徑PKS合成，因此氧氣控制也是兩步發酵中的關鍵因素，Bailey［14］等采用分批發酵方式培養Schizochytrium，在發酵過程中不斷添加玉米糖漿，保持糖的濃度為7g/L，并使用硫酸鈉作為主要的鈉鹽，且在細胞的細胞生長/分裂期保持氧氣濃度大于4%，而在脂質積累期保持氧氣濃度低于3%，并限制氮源，僅發酵90～100h，生物量高達200g/L，總脂肪酸是生物量的40%，且 DHA 高達 40～45g/L。Chi［31］等也采用轉化溶氧法，在細胞數量生長期控制溶氧為50%，在油脂積累期控制溶氧為10%，該兩步溶氧控制使Schizochytrium的生物量和DHA含量分別提高到 37.9g/L 和 6.56g/L。Jakobsen［32］等在油脂積累階段采用N，P限制和O2限制，生物量達到90～100g/L，相比無O2限制情況下，DHA占總脂肪酸含量由36%提高到52%。該兩步發酵法不僅適合ω-3多不飽和脂肪酸的生產，也適合其它單細胞油脂的生產。

4.2 代謝調控研究

國內外對Schizochytrium的研究主要集中在菌種的誘變和篩選，發酵條件的優化［15-19］，如：碳源、氮源、碳氮比、無機鹽、前體促進物質以及溶氧、pH等方面的研究。近年來，隨著對DHA合成機理進一步地認識，研究者開始對合成DHA的代謝調控進行研究，并已經取得初步進展。2005年，已初步闡明了AMP脫氫酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸酶的活性變化與甘油三酯積累的活動的關系［33］，其中蘋果酸酶是NADPH的提供者。脂肪酸合成的兩個關鍵物質是乙酰-CoA和NADPH［30］，乙酰-CoA 是油脂合成的前體，NADPH為DHA的合成提供還原力，這兩種物質的充足供應是保證脂肪酸不斷積累的重要因素。本課題組前期在總脂快速積累期，強化了乙酰-CoA和NADPH的供給，并添加4g/L蘋果酸，DHA占總脂的含量由35%提高到60%［20］。此外，向培養基中加入小分子還可對脂肪酸的分布進行調控，Schizochytrium合成的總脂肪酸中，其它脂肪酸尤其是十四烷酸（C14∶0）、軟脂酸（C16∶0）和二十二碳五烯酸（DPA）含量較高。Shirasaka［34］等向培養基中加入氰鈷胺后，奇數碳脂肪酸如十五烷酸（C15∶0）和十七烷酸（C17∶0）顯著降低；當加入甲苯甲酸后，DPA含量顯著降低，并能顯著降低DPA/DHA的值。

5 研究展望

隨著水產養殖業的迅速發展和DHA在食品和藥品等行業的應用，人們對DHA的需求將不斷擴大，通過Schizochytrium發酵產DHA具有深遠的意義和市場應用價值。目前基因工程和代謝工程對Schizochytrium基因改造和代謝途徑的分析，DHA的發酵生產確已取得一定的進展，但使其大規模化生產尚需不懈努力。Schizochytrium發酵生產DHA過程中存在細胞生長不穩定、細胞活力不高、油脂含量少及細胞代謝難以調控等難題。今后應進一步深入研究以下幾個方面：

重視高產DHA的Schizochytrium的選育。優良的菌種是DHA高產的首要因素，如何才能培養出穩定和油脂含量高的Schizochytrium是DHA高產的關鍵，因此需要加強多種方式選育和基因工程改良等方面的研究。特別是研究基于代謝途徑分析對DHA高產菌進行選育，加強主代謝流、強化能量代謝著重選育生長穩定、活力高、細胞大小均一的DHA高產菌。

分析DHA的合成機理。進一步深入地研究DHA的合成途徑、調節機制和酶的作用過程，尤其是加強對PKS途徑、合成DHA關鍵酶學性質的研究，減少其它脂肪酸含量，定向指導DHA的高效合成。

改進適合Schizochytrium發酵產長鏈不飽和脂肪酸的新型生物反應器。探索發酵罐培養條件，對發酵罐流體力學（CFD）進行研究，在發酵過程進行動力學分析的基礎上利用數學工具優化發酵過程，解決發酵過程中高黏度體系下氧傳遞、傳熱、傳質慢等發酵瓶頸問題，以優化發酵工藝，從而創造適合Schizochytrium的生長及產油的環境。

［1］Ashford A，Barclay WR，Weaver CA，et al.Electron microscopy may reveal structure of docosahexaenoic acid rich oil within Schizochytrium sp［J］.Lipids，2000，35：1377-1386.

［2］LiQ，Chen GQ，Fan KW，etal.Screening and Characterization of Squalene-Producing Thraustochytrids from Hong Kong Mangroves［ J］.Agric Food Chem，2009，57：4267-4272.

［3］Yaguchi T，Tanaka S，Yokochi T，et al.Production of high yields of docosahexaenoic acids by Schizochytrium sp.strain SR21［J］.J Am Oil Chem So，1997，74：1431-1434.

［4］Hammond B G，Mayhew D A，Naylor M W，et al.Safety assessment of DHA-Rich microalgae from Schizochytrium sp.：I.Subchronic rat feeding study［J］.Regul Toxicol Pharm，2001，33：192-204.

［5］Hammond B G，Mayhew D A，Holson，J F，et al.Safety assessment of DHA-Rich microalgae from Schizochytrium sp.：II.Developmental toxicity evaluation in rats and rabbits［ J］.Regul Toxicol Pharm，2001，33：205-217.

［6］Hammond B G，Mayhew D A，Robinson K，et al.Safety assessment of DHA-Rich microalgae from Schizochytrium sp.：III.Single-generation rat reproduction Study［ J］.J Archaeol Sci，2001，33：356-362.

［7］Hammond B G，Mayhew D A，Kier L D，et al.Safety assessment of DHA-Rich microalgae from Schizochytrium sp.：IV.Mutagenicity studies［ J］.Regul Toxicol Pharm，2002，35：255-265.

［8］Abril R，Garrett J，Zeller S G，et al.Safety assessment of DHA-rich microalgae from Schizochytrium sp.Part V：Target animal safety/toxicity study in growing swine［ J］.Regul Toxicol Pharm，2003，37：73-82.

［9］Metz JG，Roessler P，Facciotti D，et al.Production of Polyunsaturated Fatty Acids by Polyketide Synthases in Both Prokaryotes and Eukaryotes［ J］.Science，2001，293（5528）：290-293.

［10］Wallis JG，Watts JL.Polyunsaturated fatty acid synthesis：what will they think of next？［J］.Trends Biochem Sci，2002，27（9）：467-473.

［11］Qiu X.Biosynthesis of docosahexaenoic acid（ DHA，22：6-4，7，10，13，16，19）：two distinct pathways［J］.PLEFA，2003，68：181-186.

［12］Hauvermalea A，Kunera BJ，Rosenzweiga B，et al.Fatty acid production in Schizochytrium sp.：Involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type I fatty acid synthase［J］.Lipids，2006，41（8）：739-747.

［13］Barclay W R.Process for the heterotrophic production of products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids［P］.US：5130242.1992-07-14.

［14］BaileyRB，DiMasiD，HansenJM，etal.Enhanced production of lipids containing polyenoic fatty acid by very high density cultures of eukaryotic microbes in fermentors［P］.US：6607900.2003-08-19.

［15］Yokochi T，Honda D，Higashihara T，et al.Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1998，49：72-76.

［16］Ganuza E，Anderson J，Ratledge C.High-cell-density cultivation of Schizochytrium sp.in an ammonium/pH-auxostat fed-batch system［J］.Biotechnol Lett，2008，30：1559-1546.

［17］Unagul P，Assantachai C，Phadungruenglui S，et al.Biomass and docosahexaenoic acid formation by Schizochytrium mangrovei Sk-02 at low salt concentrations［J］.Botanica Marina，2006，48：182-190.

［18］Zhou L，Lu YH，ZHOU MH.Enhanced production of docosahexaenoic acid using Schizochytrium sp.by optimization of medium components［J］.J Chem eng JPN，2007，40（12）：1093-1100.

［19］陳誠.裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum SR21）發酵制備二十二碳六烯酸（DHA）過程的初步研究［D］.浙江大學生物化工學院，2007.

［20］Ren LJ，Huang H，Xiao AH，etal.Enhanced docosahexaenoic acid production by reinforcing acetyl-CoA and NADPH supply in Schizochytrium sp.HX-308［J］.Bioprocess Biosyst Eng，2009，32（6）：837-843.

［21］Song XJ，Zhang XC，Kuang CH，et al.Optimization of fermentation parameters for the biomass and DHA production of Schizochytrium limacinum OUC88 using response surface methodology［J］.Process Biochem，2007，42：1391-1397.

［22］張娟梅，江賢章，黃鍵忠.裂殖壺菌Schizochytrium sp1FJU-512細胞油脂的研究［J］.福建師范大學學報：自然科學版，2007，23（2）：75-80.

［23］Wu ST，Tsung S，Lin LP.Effect of culture conditions on docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp.S31［J］.Process Biochem，2005，40：3103-3108.

［24］Nakahara T，Yokochi T，Hifashihara T，et al.Production of docosahexaenoic and docosapentaenoic acids by Schizochytrium sp.isolated from Yap Islands［J］.J Am Oil Chem Soc，1996，73：1421-1426.

［25］Chi ZY，Pyl D，Wen ZY，et al.A laboratory study of producing docosahexaenoic acid from biodiesel-waste glycerol by microalgal fermentation［ J］.Process Biochem，2007，42：1537-1545.

［26］Takashi Y，Tsunehiro A，et al.Utilization of Shochu distillery wastewater for production of polyunsaturated fatty acids and Xanthophylls using Thraustochytrid［J］.J Biosci Bioeng，2006，102（4）：323-327.

［27］Panida U，Caetharin A，Saranya P，et al.Coconut water as a medium additive for the production of docosahexaenoic acid（C22∶6 n3）by Schizochytrium mangrovei Sk-02［J］.Bioresource Technology，2007，98：281-287.

［28］Zhu LY，Zhang XC，Pen XY，et al.Effects of cultureconditions on growth and docosahexaenoic acid production from Schizochytrium limacinum［J］.J Ocean Univ China，2008，7（1）：83-88.

［29］Fan KW，Chen F，Jones EB，et al.Utilization of food processing waste by Thraustochytrids［J］.Fungal Divers，2000，5：185-194.

［30］Ratledge C.Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production［ J］.Biochemie，2004，86：807-815.

［31］Chi ZY，Lin Y，Frear C，et al.Study of a two-stage growth of DHA-producing marine algae Schizochytrium limacinum SR21 with shifting dissolved oxygen level［ J］.ApplMicrobiol Biotechnol，2009，81：1141-1148.

［32］Jakobsen AN，Aasen IM，Josefsen KD，et al.Accumulation of docosahexaenoic acid - rich lipid in thraustochytrid Aurantiochytrium sp.strain T66：effects of N and P starvation and O2limitation［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，80：293-306.

［33］Ratledge C.Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for Single Cell Oil production.Biochimie［ J］.2004，86：807-815.

［34］Shirasaka N，Hirai Y，Yoshizumi HN.Effect of cyanocobalamin and p-toluic acid on the fatty acid composition of Schizochytrium limacinum（Thraustochytriaceae，Labyrinthulomycota）［J］.Mycoscience，2005，46：358-363.

Research progress on DHA production by Schizochytrium

WEI Ping1，MA Xiao-chen1，REN Lu-jing1，JI Xiao-jun1，HE Guang-hua2，LIU Zhen2，HUANG He1，*
（1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China；2.Zhejiang Beingmate Science，Industry and Trade Co.，Ltd.，Hangzhou 310007，China）

TS201.3

A

1002-0306（2010）10-0398-05

2009-10-15 *通訊聯系人

魏萍（1985-），女，研究生，研究方向：DHA發酵。

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2007CB707805）；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃（CX07s-032z）資助。