葛根素后處理對大鼠心肌缺血再灌注心肌細胞的影響

顏永進,張躍明,陸 洋,王世亞

心肌缺血再灌注損傷受到臨床越來越多的重視,缺血再灌注損傷成為阻礙缺血心肌從再灌注治療中獲益的主要難點,而抑制心肌細胞凋亡能有效抑制心肌再灌注損傷。葛根素(Puerarin,Pur)是中藥葛根的有效成分之一,具有擴張冠狀動脈、改善缺血區心肌血供、阻滯β受體、降低心肌耗氧量等多種藥理作用[1,2],已被廣泛用于心血管疾病的治療。研究表明,中藥Pur對再灌注損傷的心肌具有保護作用,但大多數研究都是在冠脈缺血前給予Pur預處理,而有關Pur后處理對心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究較少[3,4]。本研究旨在利用大鼠在體心肌缺血模型,觀察葛根素后處理對缺血再灌注損傷大鼠心肌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和設備 Cardiofax型心電圖機(日本NIHON KOHDEN公司);小動物呼吸機(江灣Ⅰ型微型,第二軍醫大學醫學儀器公司);Bcl-2、Bax、Tunel試劑盒購自北京中山生物工程有限公司;日本電子GEOLTEM-100S透射電鏡。葛根素由南京正大天晴公司提供。

1.2 心肌缺血再灌注模型的建立[5]以3%戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔麻醉,氣管插管,連續監測Ⅱ導聯心電圖。開胸暴露心臟,在冠狀動脈前降支距左心耳下緣2 mm處穿過絲線,夾緊絲線阻斷冠脈血流,放松絲線造成再灌注,以左室前壁發紺或呈紫色及同步心電圖示ST段抬高、QRS幅度升高為結扎成功標志,復灌時左室前壁缺血區發紺消失。

1.3 實驗分組 健康雄性SD大鼠24只,體重240 g～350 g(由南通醫學院實驗動物中心提供),隨機分成3組,每組8只。假手術組(A組):將大鼠行上述處理后,只穿線,不結扎左冠狀動脈。缺血再灌注組(B組):將大鼠行上述處理后,結扎左冠狀動脈45 min,爾后再灌注120 min。缺血再灌注+葛根素后處理組(C組):將大鼠行上述處理后,結扎左冠狀動脈 45 min,爾后再灌注120 min。再灌注前3 min和再灌注后2 min內靜脈注入葛根素150 mg/kg。

1.4 心肌組織切片的制作 A組術后165 min,B組和C組在缺血45 min、再灌注120 min后為實驗終點。實驗結束后處死動物,立即摘取心臟,剪去心房、大血管及右室,保留左室及室間隔。用4%多聚甲醛,室溫固定,石蠟包埋,連續切片,用于HE染色、T UHEL檢測、免疫組化檢測Bcl-2、Bax。

1.5 觀測指標

1.5.1 光鏡和電鏡下觀測心肌細胞形態學 光鏡下觀測各組心肌細胞的組織結構及細胞形態,電鏡觀測心肌細胞的超微結構。

1.5.2 原位末端標記(TUNEL)技術檢測心肌細胞的凋亡 各組實驗完畢后,取心肌常規脫水固定,石蠟包埋、切片,從各組取8張石蠟切片,每張切片按寶靈曼公司試劑盒(POD)提供的脫氧核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)原位檢測凋亡細胞的DNA碎片。以PBS緩沖液代替管1(TdT),進行反應作陰性對照。凋亡細胞的細胞核為深淺不一的棕黃色或棕褐色,非凋亡細胞核呈藍色。凋亡指數的計算,以單位面積內凋亡細胞數為凋亡指數(Apotosis index,AI)。每張切片隨機10個視野,每個視野計數100個細胞,每個視野計數100個細胞中凋亡的陽性數,然后加在一起再除10,即可得到凋亡陽性細胞的百分率。

1.5.3 免疫組化檢測Bcl-2、Bax蛋白水平 應用與 TUNEL法相同的組織石蠟切片行Bax、bcl-2蛋白免疫組織化學檢測。一抗1:50PBS稀釋的 Bax、bcl-2抗體。具體步驟嚴格按SP試劑盒說明操作,DAB顯色,中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。蛋白陽性表達細胞的細胞質呈棕黃色或棕褐色,細胞核呈藍色為不表達。每張切片隨機10個視野,每個視野計數100個細胞中Bax、bcl-2蛋白表達陽性的細胞數,然后加在一起再除10,即可得到蛋白陽性表達的百分率。

1.6 統計學處理 采用STATA8.0軟件進行處理,所有數據采用均數±標準差(±s)表示,對均數進行方差分析(F檢驗),兩組間比較用t檢驗。

2 結 果

2.1 心肌組織形態學分析 光鏡下:A組心肌纖維形態正常,未見明顯的壞死表現,細胞核完整,無炎性細胞浸潤;B組心肌纖維形態結構紊亂,無炎性細胞浸潤,可見凋亡細胞,呈細胞體積縮小,密度增加,但細胞器保持完整;C組心肌纖維形態趨于正常,無炎性細胞浸潤。

電鏡下:A組細胞形態正常;B組可見細胞體積縮小,核濃縮,胞質內細胞器完整,并形成凋亡小體,無炎性細胞浸潤等凋亡改變;C組細胞形態趨于正常,與B組相比,細胞損傷有明顯減輕,大部分核染色質分布均勻,超微結構趨于與A組細胞相似。

2.2 心肌細胞凋亡的檢測 A組偶見凋亡的心肌細胞,B組凋亡細胞明顯增加,呈彌漫分布,C組凋亡細胞較少。B組有較高的心肌細胞凋亡率,較A組明顯增高(P＜0.05);與B組比較,C組心肌細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)。詳見表1。

2.3 Bcl-2及 Bax蛋白表達水平 Bcl-2及Bax蛋白陽性定位于細胞質中,呈棕黃色。B組Bcl-2陽性細胞表達率明顯低于A組(P＜0.05),而Bax陽性細胞表達率明顯高于 A組(P＜0.05);與B組比較,C組Bax陽性細胞表達率明顯下降(P＜0.05),而Bcl-2陽性細胞表達率明顯上升(P＜0.05)。詳見表 1。

表1 不同處理組凋亡細胞及Bcl-2、Bax蛋白(±s)

表1 不同處理組凋亡細胞及Bcl-2、Bax蛋白(±s)

組別 凋亡指數(%) Bcl-2(%) Bax(%)A 組 0.509±0.126 5.618±0.685 0.651±0.083 B組 3.518±0.8641) 0.592±0.4131) 4.982±0.2361)C組 2.075±0.9832) 3.948±0.4132) 1.985±0.5162)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05

3 討 論

葛根素是從野生葛根中提取得到的類異黃酮類化合物,能改善微循環,擴張冠狀動脈,增加腦和冠狀動脈血流量等作用,臨床用于冠心病、高血壓等。目前已知的保護心臟,減少心肌缺血再灌注損傷最有力的方法是缺血預適應或缺血后適應[6,7]。近年來實驗及臨床研究均證實葛根素預處理對心肌I/R損傷具有良好的保護作用[8],但對于葛根素后處理以及它對細胞凋亡和凋亡相關基因 Bcl-2、Bax作用,對心肌缺血再灌注損傷的保護作用研究較少。

細胞凋亡是有許多基因參與的細胞結束其生命的過程,有著非常復雜的調控機制,其中Bcl-2基因家族是目前較為公認與凋亡密切相關的基因。Bcl-2家族正是一組通過影響線粒體外膜上通透性轉換(permeability transition,PT)通道的穩定性來調控細胞凋亡的蛋白質。Bcl家族大致可以分為兩類:Bcl-2,Bcl-xL等可以抑制凋亡;而Bax,Bad等則可以通過增加PT通道的開放來促進細胞凋亡。Bcl-2抗凋亡的作用可能與抗氧自由基,鈣超載及細胞內蛋白酶變化有關,也可能與Bcl-2能保持線粒體膜的穩定性,抑制細胞色素C和凋亡誘導因子釋放有關。Bcl-2家族中Bax功能與Bcl-2相反,具有促進細胞凋亡的作用,Bax通過與線粒體上Bcl-2蛋白形成二聚體發揮作用,當Bax高表達時,形成同源二聚體Bax/Bax促進凋亡,Bcl-2高表達時,形成異源二聚體Bcl-2/Bax以抑制凋亡的發生[9-11]。

本研究發現,正常心肌細胞有一定量的Bcl-2、Bax表達;當心肌遭遇缺血再灌注時,Bcl-2的表達下調,而Bax表達上調同時伴有心肌凋亡細胞的增多;葛根素后處理可以提高Bcl-2表達,降低Bax表達,而且顯著減少心肌細胞的凋亡。

本研究觀察葛根素后處理對缺血再灌注心肌的保護作用,對缺血再灌注心肌組織結構、細胞凋亡及相關基因Bcl-2、Bax蛋白的表達進行了觀察。葛根素后處理能明顯減少心肌細胞的凋亡,其機制可能通過上調Bcl-2蛋白表達,下調Bax蛋白表達來實現的。葛根素后處理是在心肌缺血發生之后進行的,彌補了葛根素預處理臨床應用的缺陷,因此更具臨床前景。

[1]蘇曉靈,王嶸,周白麗,等.葛根素對心肌缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究[J].臨床內科雜志,2004,21:799-781.

[2]顏永進,李明春,浦大玲,等.葛根素對心肌缺血再灌注損傷保護作用的研究[J].南通大學學報,2005,25:407-409.

[3]Mykytenko J,Kerendi F,Reeves JG,et al.Long-term inhibition of my ocardial infarction by postconditioning during reperfusion[J].Basic Res Cardiol,2007,102(1):90-100.

[4]Cao Z,Ye P,Long C,et al.Effect of pioglitazone,a peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist,on ischemiareperfusion injury in rats[J].Pharmacology,2007,79(3):184-192.

[5]毛張凡,杜心靈,孫宗全,等.阿片受體參與大鼠缺血后處理的心肌保護作用[J].華中科技大學學報:醫學版,2007,36:610-613.

[6]Murry CE,Jennings RB,Reimer KA.Preconditioning with ischemia a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74:1124-1136.

[7]Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of my ocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison withischemic preconditioning[J].Am J Physiol,2003,285:579-588.

[8]高翔,李濤,高全,等.葛根素預處理保護心肌缺血再灌注損傷的機制[J].貴陽醫學院學報,2007,32:37-41.

[9]Guo J,Zhang K,Ji Y,et al.Effects of ethyl py ruvate on my ocardial apoptosis and expression of Bcl-2 and Bax proteins after ischemiareperfusion in rats[J].Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2008,28(3):281-283.

[10]Blatt NB,Boiano AE,Lyssiotis CA,et al.Bz-423 superoxide signals B cell apoptosis via Mcl-1,Bak and Bax[J].Biochem Pharmacol,2009,78(8):966-973.

[11]Fernandez-luna JL.Regulation of pro-apoptotic BH3-only proteins and its contribution to cancer progression and chemoresistance[J].Cell Signal,2008,20(11):1921-1926.