安心顆粒對心力衰竭大鼠血清一氧化氮及心肌JAK蛋白表達的影響1)1

江 雪,方顯明

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是催化一氧化氮(nitric oxide,NO)合成的關鍵酶。有研究表明[1],NO與慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)的發生發展有關。Junus激酶-信號轉導子與轉錄激活子通路(Junus kinnases-signal transducer and activators of transcription,JAK-STAT)是CHF發病的重要機制之一。而目前JAK1被認為是JAKs家族中激活STAT通路的主要激酶[2]。但NO與JAK1關系的研究鮮見報道。本研究擬通過動物實驗,探討CHF過程中NO與JAK1的關系及安心顆粒干預的作用?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD大鼠72只,雌性,體重(180±20)g,由廣西醫科大學實驗動物中心提供(許可證號:SCXK桂2003-0003)。

1.1.2 藥物與試劑 藥物:安心顆粒[每包3.5 g,含生藥4.5 g,由培力(南寧)藥業有限公司提供,批號 060301];卡托普利片(每片25 mg),由湖南湘雅制藥有限公司生產,批號0710104;鹽酸阿霉素(adriamycin,ADR)粉針,由浙江海正藥業有限公司生產,批號071101A。試劑:JAK1多克隆抗體(一抗),羊抗兔多克隆抗體(二抗)均購于美國 SANTA CRUZ公司。NO、NOS試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 BL-420E+生物信號采集系統(成都泰盟科技有限公司);高速冷凍離心機5810R型(德國 Eppendorf公司);凝膠成像分析系統(美國ALPHA公司);基礎電泳儀、垂直電泳槽、可編程高壓電泳儀Power3000、電轉槽153BR53477(美國BIO-RAD公司);全自動酶標儀(奧地利CliniBio公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照文獻[3]方法,將注射用阿霉素粉針用滅菌生理鹽水5 mL溶解,生理鹽水稀釋配成每l mL生理鹽水含藥0.8 mg溶液,1周～3周按3 mg/kg劑量給模型組和用藥組大鼠行腹腔注射,4周～6周以2 mg/kg劑量,1次/周;正常對照組注射等量的生理鹽水,1次/周。均連續注射給藥6周。造模過程中觀察并記錄大鼠表征及行為改變情況。

1.2.2 動物分組與給藥 72只SD大鼠隨機分為6組:正常對照組(A組)、模型組(B組)、卡托普利組(C組)、安心顆粒小劑量組(D組)、安心顆粒中劑量組(E組)、安心顆粒大劑量組(F組)。每組12只。C組、D組、E組、F組分別給予卡托普利劑量6.25 mg/(kg?d)、安心顆粒 0.8 g/(kg?d)、安心顆粒1.2 g/(kg?d)和安心顆粒1.6 g/(kg?d)灌胃(藥物劑量按動物與人體表面積等量換算),A組、B組予等容生理鹽水灌胃,每日1次,共 6周。實驗中,室溫控制在(20±2)℃,大鼠飲食自由,飲水不限。

1.2.3 心功能指標測定 末次灌胃給藥24 h內,大鼠用4%戊巴比妥鈉腹腔內注射麻醉,取頸前正中切口,分離頸總動脈,用肝素抗凝的導管經右頸總動脈插入左心室并固定,經壓力換能器將導管與微機相連,通過BL-420E+生物機能實驗系統進行監測。分別測定心率(HR)、動脈收縮壓(SAP)、動脈舒張壓(DAP)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張期末壓(LVEDP)、左室內壓變化速率(±dp/dtmax)等指標。然后剖胸取出心臟,PBS液冰浴清洗,用濾紙拭干后稱取整個心臟。稱重后-80℃保存。心臟質量指數(heart mass index,HMI)按公式計算:HMI=心臟重量(HW)/體重(BW)[4]。

1.2.4 血清NO、NOS測定 于大鼠股動脈取血,經4℃4 000 r/min離心15 min,分離出血清,置于-80℃冰箱中備測。NO和NOS測定用化學比色法,按試劑盒說明書操作。

1.2.5 心肌蛋白質測定 采用Western Blot法,將心肌組織剪碎,加入裂解緩沖液,冰浴下勻漿,4℃12 000 r/min離心15 min,取上清,加入上樣緩沖液,用酶標儀測定 A562,根據標準曲線計算出樣品蛋白質濃度?？偟牡鞍滋崛∥锝?%SDS-PAGE電泳、將蛋白轉移至PVDF膜,然后按照標準蛋白質印跡法與1∶300稀釋的抗JAK1多克隆抗體冰上孵育1.5 h后,洗脫,5%脫脂奶粉冰上封閉 1 h,漂洗后加入1∶5 000稀釋的二抗,室溫下孵育1 h后,洗脫,予化學發光試劑增強反應,X光壓片曝光,漂洗顯影,用薄層掃描儀測定條帶的密度值。

2 結 果

2.1 各組大鼠行為學變化 實驗觀察到,A組大鼠毛色光澤,雙眼靈活有神,行動敏捷,對周圍變化靈敏。B組從第2次腹腔注射ADR后出現活動減少、蜷縮、納食減少、皮毛松軟、脫毛、體重減輕等,第4次注射后出現程度不一的腹水,尿少便溏,呼吸減弱,口唇及雙耳發紺等,并開始出現死亡。C組、D組、E組、F組從第 3次腹腔注射ADR后逐漸出現活動減少、蜷縮、納食減少、皮毛松軟、體重減輕等,但較B組輕;第5次注射后少數大鼠出現腹水、呼吸減弱,口唇發紺等。實驗過程中,存活大鼠共66只。

2.2 各組心功能指標改變 造模6周后,與正常對照組比,模型組 HR、SAP、DAP、LVSP、LVEDP、HMI均增高(P ＜0.01),而±dp/dtmax均降低(P＜0.01),提示左心室后負荷增加、心肌肥厚和心肌收縮力下降已存在,心力衰竭模型造模成功。與模型組比較,各用藥組 HR、SAP 、DAP 、LVSP、LVEDP 、HMI均降低(P＜0.05或 P＜0.01),±dp/dtmax顯著升高(P＜0.01)。提示安心顆粒與卡托普利相似,有改善心功能的作用。詳見表1、表2。

表1 各組大鼠 HR、SAP、DAP、HM I的比較( ±s)

表1 各組大鼠 HR、SAP、DAP、HM I的比較( ±s)

組別 n HR(bp/m) SAP(mmHg) DAP(mmHg) HM I A組 11 347.5±17.7 120.6±7.6 76.2±8.0 3.7±0.2 B組 11 393.7±12.42) 150.2±7.02) 93.7±4.42) 5.1±0.42)C組 11 368.1±12.44) 131.9±7.14) 83.5±7.14) 4.3±0.14)D組 11 369.6±8.34) 135.9±5.04)7) 85.3±4.34)7) 4.3±0.24)8)E組 11 366.2±8.54) 128.0±6.34) 76.9±8.04)5) 3.9±0.24)6)F組 11 389.4±5.26)8) 136.9±5.14)8) 84.9±4.04)7) 4.8±0.43)6)8)與A組比較,1)P＜0.05,2)P＜0.01;與B組比較,3)P＜0.05,4)P＜0.01;與C組比較,5)P＜0.05,6)P＜0.01;與E組比較,7)P＜0.05,8)P＜0.01

表2 各組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax比較( ±s)

表2 各組大鼠LVSP、LVEDP、±dp/dtmax比較( ±s)

組別 n LVSP(mmHg) LVEDP(mmHg) +dp/dtmax(mmHg/s) -dp/dtmax(mmHg/s)A組 11 158.0±9.4 3.4±2.8 3 352.7±514.1 2 626.4±509.5 B組 11 185.6±15.01) 11.7±3.31) 1 176.2±231.01) 861.9±91.71)C組 11 174.4±8.22) 8.1±2.43) 2 119.7±395.83) 1 830.5±258.03)D組 11 173.2±12.62) 6.6±2.33) 2 401.7±581.93) 2 230.1±486.83)4)5)E組 11 171.3±11.82) 6.8±2.23) 2 102.3±392.63) 1 761.0±443.33)F組 11 170.2±10.02) 5.8±2.13)4) 1 870.1±315.53) 1 428.5±548.83)與A組比較,1)P＜0.01;與B組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01;與C組比較,4)P＜0.05;與E組比較,5)P＜0.05

2.3 各組血清 NO、NOS濃度比較 B組 NO、NOS血清濃度均高于A組(P＜0.01);而C組、D組、E組及F組 NO、NOS濃度均低于 B組(P＜0.05或P＜0.01),各用藥組之間無統計學意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組給藥后血清NO、NOS濃度比較( ±s) mmol/L

表3 各組給藥后血清NO、NOS濃度比較( ±s) mmol/L

組別 n NO(μ mol/L) NOS(U/mL)A組 11 25.7±13.5 28.8±10.1 B組 11 55.4±10.81) 56.2±14.61)C組 11 36.7±13.23) 37.2±11.63)D組 11 41.5±15.22) 46.8±10.6 E組 11 34.6±9.13) 39.2±11.13)F組 11 39.7±12.62) 50.4±5.8與A組比較,1)P＜0.01;與B組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

2.4 各組大鼠心肌JAK1蛋白表達及灰度(見圖1、表4) B組JAK1蛋白表達均高于A組(P＜0.01);C組、E組、F組蛋白表達均低于B組(P＜0.05或 P＜0.01),各用藥組之間無統計學意義(P＞0.05)。

圖1 各組大鼠心肌JAK1蛋白表達

表4 各組大鼠心肌JAK1蛋白灰度值表達(±s)

表4 各組大鼠心肌JAK1蛋白灰度值表達(±s)

組別 n JAK1/GAPDH A組 11 8.2±2.0 B組 11 19.0±4.61)C組 11 13.6±2.83)D組 11 17.0±4.6 E組 11 15.2±3.82)F組 11 14.7±3.42)與A組比較,1)P＜0.01;與B組比較,2)P＜0.05,3)P＜0.01

3 討 論

已往的研究表明,CHF患者有血管內皮功能異常。心力衰竭時血管內皮細胞分泌NO增多,NO過度增多可對心肌造成直接損害,降低心肌收縮力[5]。心力衰竭時有廣泛的心肌細胞凋亡存在,在CHF的發生發展中起重要作用[6]。本實驗結果中,B組血清NO、NOS濃度均增高,提示大鼠在CHF形成的過程中,血管內皮細胞NO、NOS代償性的分泌增多。給予安心顆粒,可降低血清 NO、NOS濃度,與卡托普利作用相似,提示安心顆粒有抑制NO、NOS和心肌細胞凋亡作用。

CHF發病與多種致病機制共同參與有關,其中JAK-STAT信號通路是一個重要的發病機制。目前已知JAKs家族成員有4 個(JAK1、JAK2、JAK3、TyK2),JAK1作為 JAKs家族成員之一,在各種細胞因子及其受體作用下,經酪氨酸磷酸化后活性增強,從而激活其下游的STAT信號分子,使JAK1-STAT3傳導通路持續活化。STAT3酪氨酸磷酸化后發生核轉位,結合特定的DNA序列,激活介導心肌肥厚相關基因,引發心肌重塑[7]。本實驗結果表明,給予安心顆粒,可使心力衰竭大鼠心肌JAK1的表達活性受到抑制,其作用與卡托普利相似。NOS分為原生型(cNOS)和誘生型(iNOS)。后者可在多種細胞中表達,如炎性中性粒細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞等。有研究發現[8],JAK/STAT活化可使iNOS及NO合成增加,大量生成的NO最終引起血管病理性舒張塌陷、對血管收縮劑反應性下降以及降低心肌收縮力等一系列病理改變。iNOS和NO的大量合成與多種機制有關,其中JAK途徑有著非常重要的作用,抑制JAK1的活性可下調細胞iNOS的表達。本實驗結果顯示,B組心肌JAK1蛋白表達增強時血清NO、NOS濃度亦升高,提示CHF形成過程中血清中NO、NOS水平與 JAK1活化有關。給予安心顆粒,可使心肌 JAK1蛋白表達下調及血清NO、NOS濃度降低。安心顆粒是由人參、桂枝、瓜蔞殼、水蛭、茯苓等藥組成,具有補氣通陽、化痰逐瘀、強心利尿之功。以往的實驗研究證實該藥有抑制心力衰竭大鼠心肌細胞凋亡、改善心功能的作用[9]。本次實驗結果提示該藥可通過抑制JAK1蛋白表達,降低 NO、NOS的活性,阻斷JAK-STAT信號通路,抑制細胞凋亡和心肌重塑,改善心肌舒縮功能,從而達到防治CHF的目的。至于其作用機制,尚有待進一步研究。

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