搜風祛痰法中藥對AngⅡ誘導人臍靜脈內皮細胞NF-κ BmRNA及ET-1mRNA表達的影響1)

丁亞芳,宮麗鴻,高 峰,劉 丹,高冬梅,杜玉杰

動脈粥樣硬化(atheroscierosis,AS)是心腦血管疾病的重要病理基礎,也是臨床心腦血管疾病發生和引起死亡的主要原因。AS是一種特殊的慢性炎癥過程,這種炎癥過程源于血漿脂蛋白、各種細胞組分與動脈壁細胞外基質間的相互作用[1,2]。近年來患病人群有逐步年輕化趨勢[3],嚴重危害人類身體健康。因此,研究內皮細胞功能及代謝的變化對探討AS發病機制具有重要意義。血管緊張素Ⅱ(angiotensionⅡ,AngⅡ)可導致內皮細胞損傷,誘發血管炎癥反應。本實驗旨在研究搜風祛痰法

對血管緊張素Ⅱ誘導血管內皮細胞(EC)核轉錄因子(NF-κ B)mRNA及內皮素-1(ET-1)mRNA表達的影響來預防AS的發生,并為治療AS提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物 活心湯組方:全蝎 15 g,蜈蚣2條,地龍20 g,陳皮15 g,半夏15 g,白術15 g,水蛭 15 g。由遼寧中醫藥大學附屬醫院中藥局提供,加工制成含生藥2 g/mL中藥濃縮液4℃冰箱保存備用。

1.2 動物 健康新西蘭大耳白兔(遼寧中醫藥大學動物實驗中心)清潔級,雌雄不拘,體重2.0 kg～2.5 kg。

1.3 儀器 高速冷凍離心機(Sigma 3C15K美國);超凈工作臺(蘇州凈化公司);CO2恒溫培養箱(THEROM HERAce11150);倒置顯微鏡(OLYMPUS IX71);PCR儀(Biometra UnioⅡ型,德國);紫外分光光度計(UV-3000,英國);凝膠自動成像及分析系統(Chemi Imager 5500,美國)。

1.4 試劑 AngⅡ(美國Sigma公司);胰蛋白酶(Gibco公司);DMEM(美國gibco公司);PCR引物(北京華大基因公司合成);胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)。

1.5 藥物血清制備 隨機將兔分為4組,空白對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組5只。后3組分別灌胃活心湯,以人臨床用量×動物等效計量比值×血清稀釋度為參考給藥量,空白對照組給等容積的蒸餾水。連續5 d,第5天灌胃后2 h頸動脈放血,分離血清,56℃30 min滅活,低溫干燥,置-80℃保存備用,臨用時用DM EM培養液配成10 mg/mL的濃度,再用0.22 μ m 的微孔濾膜過濾除菌。

1.6 HUVEC培養及鑒定 人臍靜脈內皮細胞株原代(遼寧中醫藥大學檢驗科提供),用含20%胎牛血清的DMEN/F12培養基在37℃CO2培養箱中培養至融合狀態,再用0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代。培養的HUVEC細胞形態符合內皮細胞特征,抗人ⅤⅢ因子抗體染色陽性。將培養的第2-3代細胞用于實驗。

1.7 實驗分組 隨機分5組:正常對照組(空白血清);AngⅡ組(0.5μ mol/L)組;低濃度中藥血清+AngⅡ組:0.5 μ mol/L AngⅡ+2.5%中藥血清;中濃度中藥血清+AngⅡ組:0.5 μ mol/LAngⅡ+5%中藥血清;高濃度中藥血清+AngⅡ組:0.5 μ mol/L AngⅡ+10%中藥血清。用中藥血清事先孵育2 h后再加入 AngⅡ0.5 μ mol/L刺激2 h,收集細胞。

1.8 RT-PCR法測定內皮細胞NF-κ B、ET-1 mRNA 采用Trizol試劑一步法提取組織總RNA,紫外分光光度計測定純度并定量。根據中國醫科大學提供的NF-κ B及 ET-1和內參照β-actin的mRNA序列,應用軟件Primer Premier 5.0自行設計引物。詳見表1。

表1 引物序列表

反應條件:94℃5 min,1個循環;94℃30 s,59℃30 s,72℃1 min,35個循環;72℃5 min后結束擴增反應。取5 μ L PCR產物與2 μ L Lodding Buffer混合,進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,100 V 1.5 h,電泳結束后,凝膠成像儀成像分析。

1.9 統計學處理 SPSS12.0軟件,數據以均數±標準差(±s),兩組間比較用t檢驗,多組間比較用方差分析,相關分析采用直線相關。

2 結 果

2.1 活心湯對血管緊張素Ⅱ誘導血管內皮細胞 NF-κ B mRNA表達的影響 正常對照組 NF-κ B mRNA表達最低,AngⅡ組表達明顯高于其他4組(P＜0.05)。3個中藥血清組 NF-κ B mRNA表達比AngⅡ組顯著降低(P＜0.05),與低濃度組中藥血清相比,中高濃度中藥血清組抑制NF-κ BmRNA表達更加明顯(P＜0.05)。詳見表1。

圖1 血管內皮細胞NF-κ B mRNA表達

2.2 活心湯對AngⅡ誘導血管內皮細胞ET-1 mRNA表達的影響 正常對照組 ET-1 mRNA表達最低,AngⅡ組的 ET-1 mRNA表達明顯高于其他4組(P＜0.05)。3個中藥血清組ET-1 mRNA表達比AngⅡ組顯著降低(P＜0.05),與低濃度組中藥血清相比,中高濃度中藥血清組抑制ET-1 mRNA表達更加明顯(P＜0.05)。詳見圖 2。

圖2 血管內皮細胞ET-1 mRNA表達

3 討 論

血管內皮是位于血管腔內面的單層細胞上皮,介于血液和平滑肌之間,不僅起一種機械的屏障作用,還參與多種調節機制,因而成為血管疾病的一個基本靶點和調節點?，F已證實,內皮功能紊亂貫穿于動脈粥樣硬化進程的各個階段[4]。

NF-κ B是Sen和Baltimore首先報道,是一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κ B序列特異結合的蛋白因子,具有多向轉錄調節作用,尤其在細胞因子誘導的基因表達中起關鍵性調控作用。細胞處于靜息狀態時,NF-κ B以無活性的三聚體形式存在于細胞質中,受到多種細胞因子激活,啟動和調控相關基因轉錄[5]。這些因子在機體免疫應答、炎癥反應和細胞生長發育等方面發揮著重要作用[6,7]。新近研究發現,NF-κ B亦存在于血管內皮細胞、血管平滑肌細胞(smooth muscle cell,SMC)及心肌細胞中,參與多種心血管疾病的發生和發展過程[8-10]。NF-κ B依賴性基因協同誘導表達,促使血管壁產生動脈硬化效應,這種效應持續存在,刺激SMCs遷移、增殖,使循環血單核細胞不斷聚集,進一步產生細胞因子、化學因子、生長因子,因此 NF-κ B在致AS信號初始反應、進展中均扮演重要角色[11]。

ET是1988年日本學者Yanagisawa等從豬主動脈內皮細胞中分離純化的一種多肽物質,是內皮細胞依賴性收縮因子的主要成分,是迄今最強的血管收縮因子[12]。ET有3種同分異構體:ET-1、ET-2和ET-3。其中 ET-1的心血管效應最強。動脈粥樣硬化早期的一項病理生理變化是單核細胞向血管內膜層移行、活化并刺激多種因子釋放。已在體外證實,內皮素能夠作為單核細胞趨化劑使用,因此內皮素可能是動脈粥樣硬化的一個始動因子,也能夠刺激血管平滑肌細胞的移行和增生,從而促進動脈粥樣硬化的進程[13]。

AS可涉及祖國醫學癡呆、中風、胸痹、真心痛、厥心痛、痰飲等病癥。本病的病理變化為本虛標實,虛實夾雜。本虛可累及心、肝、脾、腎四臟,為病之本,以痰瘀毒互阻為病之標,正虛邪實相互影響,致使病變不斷發展。正如《血證論》瘀血既久亦可化痰水。隨著生活水平的提高和生活方式的改變,過食肥甘厚味、嗜好煙酒,釀生痰濁瘀血的胸痹患者日益增多。痰濁能使LDL升高,LDL可使巨噬細胞產生ET-1,從而增加內皮素的形成和釋放[14],AngⅡ可以使血管收縮引起血瘀,而中醫有津血同源理論,且津停為痰,又認為久病入絡,宜搜風通絡祛痰,治血與治風相通,從痰從風論治?；钚臏街腥Ⅱ隍季哂邢L止痙、攻毒散結、通絡止痛之效。地龍具有清熱熄風,通絡利尿之效。陳皮半夏白術三者既能燥濕化痰,又能理氣健脾消痞散結。水蛭為蟲類活血化瘀藥,破血逐瘀而不傷新血。諸藥合用共奏搜風祛痰,祛瘀通絡之功效。現代藥理研究證實,全蝎中含卵磷脂是膽堿的供體,可減少和清除血管壁上膽固醇的沉積,降低血液黏稠度,改善血氧供應。蜈蚣有抗心肌缺血、抗炎、鎮痛、改善機體免疫功能、抗衰老等作用[15-16],地龍具有解熱鎮靜、抗驚厥、平喘、抗血栓、降壓等作用[17];陳皮提取物有明顯的清除自由基、羥自由基和抗脂質過氧化作用,對自由基引起的細胞膜氧化損傷有保護作用[18],并能抗衰老、增強生命活力。水蛭能增加腦血流量,改善腦缺氧狀況,降低血流黏稠度及降血脂,抑制體內外血栓形成[19]。上藥合用,能夠更好地起到防止動脈粥樣硬化的作用。

本實驗研究顯示,血管緊張素Ⅱ可引起細胞內皮損傷,導致VEC功能紊亂,加劇炎癥反應,致使 NF-κ B mRNA及 ET-1 mRNA表達升高,搜風祛痰法能有效地抑制細胞損傷后NF-κ B mRNA及 ET-1 mRNA表達,改善血管內皮功能,減輕內皮損傷,從而有效地防止動脈粥樣硬化的發展,為治療 AS提供理論基礎,但其全面深入的作用機制還有待進一步研究探討。

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