全蝎純化液對凝血酶誘導血管內皮細胞纖溶活性的影響1)

譚 琥,彭延古,黃 鶯,徐愛良,李路丹,易小民

血管內皮細胞(vascular endothelia cells,VEC)是鋪陳與血管壁內側的一種多功能的細胞,對血栓與止血、炎癥與免疫和血管新生、物質轉運等多種生理病理過程具有重要的調節功能[1]。VEC在生理情況下具有強大的抗凝和抗血栓功能,但在某些病理及凝血酶、白介素-1(IL-1)和NEAV等的作用下卻表達出促凝活性[2]。正常情況下,內皮細胞可分泌組織型纖溶酶原激活物(t-PA)和纖溶酶原激活物抑制劑(PAI),具有較強的調節纖溶的功能。t-PA可促進纖溶酶原活化,對纖溶有很強的促進作用;而PAI可對其起到抑制作用,二者構成一對平衡物質,共同維持機體纖溶功能的平衡穩定。本研究以凝血酶-血管內皮細胞建立模型為對象,研究全蝎純化液對凝血酶誘導的VEC纖溶功能改變的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人臍靜脈內皮細胞(VEC-340)由武漢大學典型物種保存中心提供。全蝎購自湖南省醫藥公司,經水煮、醇沉,經凝膠沉析、離子交換沉析等分離純化過程將其制備、凍干備用。凝血酶購自Sigma公司,RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司,小牛血清(FCS)購自杭州四季青公司;胰蛋白酶購自美國Gibco公司,CO2培養箱為美國 Sheldon Manufacturing inc公司產品,酶標儀為芬蘭Labsystens集團產品,倒置顯微鏡為日本Olympus產品,超凈工作臺為蘇州凈化設備公司提供。t-PA、PAI檢測試劑盒購自上海太陽生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 內皮細胞培養和鑒定 將VEC-340細胞株用Hank’s液清洗后以0.25%胰蛋白酶消化,用含10%FCS的RPMI 1640培養液終止反應,離心棄上清液,用 RPMI 1640培養液(10%FCS,100 kU/L青霉素,100 kU/L鏈霉素,pH7.2)制成7.5×104/mL細胞懸液,接種于培養板中,37℃,5%的CO2培養箱中培養,每2 d換液1次,待細胞長融合后,用于實驗。實驗選用經Ⅷ因子免疫熒光檢測并生長良好的第2代～第3代內皮細胞。

1.2.2 實驗分組 同前培養的VEC-340融合后,隨機分為空白組、凝血酶(終濃度10 U/mL)組及全蝎大劑量(24 μ g/mL)、中劑量(12 μ g/mL)、小劑量(6 μ g/mL)組。空白組加入等量培養液。

1.2.3 檢測指標與方法 取上述各組培養液分別檢測t-PA,采用發射底物法。PAI采用發射底物法。方法參照試劑盒說明書進行檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行分析,數據以均數±標準差(±s)表示,采用 t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

與空白組比較,凝血酶組t-PA活性降低,PAI活性增高,差異有統計學意義(P＜0.01),與凝血酶組比較,全蝎大劑量、中劑量、小劑量組t-PA活性均增高,PAI活性降低,差異均有統計學意義(P＜0.01)。詳見表1。

表1 全蝎純化液對凝血酶誘導VEC釋放t-PA、PAI活性的影響(±s)

表1 全蝎純化液對凝血酶誘導VEC釋放t-PA、PAI活性的影響(±s)

組別 孔數(孔) t-PA(kU/L) PAI(kAU/L)空白組 10 0.66±0.04 0.86±0.02凝血酶組 10 0.55±0.051) 1.69±0.121)全蝎大劑量組 10 1.08±0.122) 0.63±0.012)全蝎中劑量組 10 0.89±0.062) 0.97±0.022)全蝎小劑量組 10 0.75±0.072) 1.12±0.112)與空白組比較,1)P＜0.01;與凝血酶組比較,2)P＜0.01

3 討 論

血管內皮細胞不僅是血液與血管內皮細胞之間的生理屏障,而且是高度活躍代謝庫,它既能合成和釋放多種抗栓、溶栓成分,如血栓調節蛋白(TM)、t-PA、前列環素(PGI2)、內皮舒張因子(EDRF),而具有抗血小板聚集,擴張血管和促纖溶作用,又能在受到刺激或損傷時釋放多種促血栓形成物質,如凝血因子、內皮素、PAI,引起血栓形成[3-6]。對組織血管血栓形成和微循環障礙有重要影響。觀察 t-PA和PAI比值的變化可以評價纖溶系統的改變,并間接的反應血管內皮細胞的功能[7]。t-PA和PAI是纖溶系統一對重要調節因子,t-PA是纖溶的重要生理性刺激劑,啟動生理性纖溶,消除血管床上的纖維蛋白沉積,機體通過其來消除血管內部適當的血栓形成;PAI則是t-PA的快速抑制劑[8],可由VEC合成和分泌。內皮細胞可以合成分泌多種血管活性物質,如 PAI-I、t-PA、血管性假血友病因子(vWF)、內皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)等,可調節血管張力,影響凝血纖溶功能,維持血管內皮促血栓形成與抗血栓形成兩種作用之間的平衡[9]。兩者均可由VEC合成,t-PA活性降低,PAI活性增高,可導致血栓形成。t-PA和PAI作為反映纖溶的主要指標,同時亦反映血管內皮功能。是調節纖溶系統功能的關鍵物質,因此兩者在血栓并發癥和心血管疾病的發生發展中起重要作用。

近年來研究表明,血栓性疾病的發生與t-PA和PAI含量及活性的變化有密切關系,凝血酶能增強內皮細胞的通透性,且這種反應與內皮細胞收縮反應一致[10]。本實驗觀察到全蝎純化液可明顯提高凝血酶誘導血管內皮細胞t-PA的活性,降低t-PA的活性,提示全蝎純化液抗栓、溶栓機制可能與影響VEC合成和分泌t-PA和PAI有關。由于t-PA的活性增強,PAI活性減弱,而呈現纖溶作用,可防止血栓形成,使血栓溶解。至于全蝎純化液是通過何種途徑使內皮細胞合成和分泌 t-PA和PAI發生改變,提示可能是其降低VEC的纖溶抑制物活性,從而使VEC的纖溶活性提高,對促進血栓溶解有重要意義。

[1] 陳頌,葛金文,賀石林,等.血管內皮細胞凋亡研究進展[J].血栓與止血學,2001,7(2):88-90.

[2] Tomas B,Aly K,Jonathan FT,et al.Apoptotic vascular endothelial cells become procoagulat[J].Blood,1997,89(7):2429-2431.

[3] Cadroy Y,Hatker LA.Phtets,thrombosis and antithrombotics[M].Cardiovascular Pharmacology:Thirded New Yo rk:Raven Press,1990:515-539.

[4] Metha P,Metha JL.Anticoagulants[M]//Singh BN.Cardiovascular pharmacology and therapeutics.New Yo rk:Churchill Livingstone Press,1994:281-288.

[5] Gersh BI,Opie LH.Anticoagulants,and fibrinolytics[M]//Opne LH.Drug s fo r the heart.4thed.Philadelphia:Saunders Co,1995:248-249.

[6] Becket RC.Seminars in thrombosis.T hromboly sis and vascular biology the vascular endothelium[J].Cardiology,1991,78(1):13-22.

[7] U rano T.Fluctuation of t-PA and PAI antigen levels in plasma:Difference of their fluctuation patterns between male and female[J].Thron Res,1990,60:133.

[8] 萬海同,白海波,楊潔紅,等.養陰方對培養人臍靜脈內皮細胞抗凝和纖溶功能的影響[J].中國中西醫結合急救雜志,2001,8(6):335-337.

[9] Anderson TJ.Assessment and treatment of endothelial dy sfunction in humans[J].J Am Coll Cardiol,1999,34(3):631-638.

[10] Nobe K,sone T,Paul RJ,et al.Thrombin-induced force development in vascular endothlial cells:Contribution to alteration of permeability mediated by calcium-dependent and in dependent pathways[J].J Pharmalol Sci,2005,99(3):252-263.