RP-HPLC測定宮瘤消片中芍藥苷的含量

張 迪 ，馬曉璐 ，張國剛

(1.遼寧省遼陽市藥品檢驗所，遼寧遼陽 111000；2.沈陽藥科大學，遼寧沈陽 110016)

宮瘤消片是在已有國家標準同類產(chǎn)品宮瘤消膠囊基礎上經(jīng)改劑型而制成的片劑新藥。臨床用于子宮肌瘤屬氣滯血瘀證，證見：月經(jīng)量多，夾有大小血塊，經(jīng)期延長，或有腹痛，舌暗紅，或邊有紫點、瘀斑，脈細或細澀[1]。本品由牡蠣、牡丹皮、香附、白花蛇舌草等十一味藥組成的復方制劑，化學成分較為復雜，而牡丹皮在處方中是重要的活血化瘀，軟堅散結(jié)藥物，是反應制劑功能主治的重要組成成分。近代藥理研究表明，牡丹皮有抗凝血、降壓、抗感染、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功能[2]。因此通過參考有關文獻，采用法HPLC[3-4]對方中牡丹皮中芍藥苷的含量進行測定，并結(jié)合分散片劑型特點，開展方法學研究。結(jié)果表明，文中方法具有靈敏、準確、重復性好等優(yōu)點，可用于本品的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100液相色譜儀；sartorius BP211D電子天平（感量 0.1 mg；0.01 mg）；USC-502 超聲波清洗器。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（110736-200526，供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈，甲醇均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取芍藥苷對照品適量，用甲醇溶解并制成每毫升含0.1 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 提取溶劑的考察 取宮瘤消片樣品 （批號：050601），研細，取約1.163 g，2份，精密稱定，置50 ml具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇、乙醇各20 ml，稱定重量，超聲處理（300 W，25 kHz）20 min，取出，放冷，再稱定重量，分別用各自溶媒補足減失重量，搖勻，濾過，作為供試品溶液。用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液按正文色譜條件測定，計算含量，分別為0.462 mg/g（甲醇）、0.456 mg/g（乙醇）。 以甲醇作為提取溶劑芍藥苷的含量較乙醇高，故試驗選用甲醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取方法的考察 試驗對超聲處理、回流提取進行了對比。取同一批樣品適量，研細，取約1.163 g，2份，精密稱定，一份置50 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 ml，稱定重量，超聲處理（300 W，25 kHz）20 h，取出，放冷，再稱定重量，補足減失重量，搖勻，濾過，濾液，作為供試品溶液；另一份置50 ml錐形瓶中，精密加甲醇20 ml，稱定重量，水浴回流20 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液，作為供試品溶液。取供試品溶液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液按正文色譜條件測定，計算含量，分別為0.435 mg/g（超聲）、0.438 mg/g（回流）。超聲處理與加熱回流相比，含量無顯著性差異，故選擇超聲處理樣品。

2.2.3 提取時間的考察 取同一批樣品，研細，取約1.163 g，4份，精密稱定，置50 ml錐形瓶中，精密加甲醇20 ml，稱定重量，超聲處理（300 W，25 kHz）10、20、50、60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，濾液，作為供試品溶液。取供試品溶液用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液按正文色譜條件測定，計算含量，分別為 0.365、0.468、0.462、0.470mg/g。超聲20、50、60 min芍藥苷含量沒有明顯的變化，為了節(jié)省時間，合理利用資源，故試驗選擇超聲提取時間為20 min。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

實驗參照國家食品藥品監(jiān)督管理局宮瘤消膠囊標準，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）為流動相；檢測波長為230 nm。流速：1.0 ml/min，柱溫：30℃，以 Agilent-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱為分析柱，進行試驗研究，結(jié)果芍藥苷與樣品中其他組分色譜峰可基線分離，芍藥苷與其相鄰色譜的分離度大于1.5；按芍藥苷峰計算，理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應不低于2 000。見圖1。

2.4 標準曲線的制備

分別精密吸取對照品溶液 2、4、6、8、10 μl按正文色譜條件進行分析，測定峰面積，結(jié)果見表1、圖2。以對照品進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程，結(jié)果表明芍藥苷進樣量在0.2～1.0 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關系。回歸方程為 Y=1 050.2X+44.93（r=0.999 2）。

表1 標準曲線測定結(jié)果Tab.1 The result of standardized curve

2.5 穩(wěn)定性試驗

取本品（批號：050601）20 片，研細，稱取粉末 1.163 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在制備樣品后的0、2、4、8，12 h進樣測定，測得芍藥苷峰面積的平均值為330.46，RSD為1.21%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

取本品（批號：050601）20片研細，稱取 5份，各 1.163 g，精密稱定，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，并進行測定，芍藥苷的平均含量為0.486 7 mg/g，RSD為1.29%，結(jié)果表明本法重現(xiàn)性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：050601，含量：0.5538mg/g）5份，分別精密加入對照品溶液1 ml，濃度為0.1 mg/ml，按上述條件依法測定。結(jié)果見表2。本法平均回收率為99.26%，RSD=1.65%，表明回收率的重現(xiàn)性較好。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery test

2.8 樣品含量測定

按照質(zhì)量標準正文含量測定項下芍藥苷測定方法對10批中試及試生產(chǎn)成品的芍藥苷含量進行了測定，每批平行測定2次，結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取芍藥苷對照品甲醇溶液，以甲醇為空白，于200～400 nm波長處進行光譜掃描，由光譜圖可見，對照品芍藥苷在230 nm波長處有一特征吸收波長，故試驗選擇230 nm作為檢測波長。

3.2 流動相的選擇

本實驗曾經(jīng)試過乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液等不同的流動相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸溶液調(diào)pH值可獲得較好峰形和適合的極性范圍，最終確定流動相的比例為乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）獲得較好的分離，分離度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05。

表3 樣品含量測定結(jié)果Tab.3 Content determination results of samples

3.3 提取方法的選擇

對于本品分別考察了甲醇、乙醇作為提取溶劑，結(jié)果顯示以甲醇作為提取溶劑，芍藥苷的含量較乙醇高，故試驗選用甲醇作為提取溶劑；采用超聲、回流不同提取方式，超聲處理與加熱回流相比，結(jié)果表明含量無顯著性差異，故選擇超聲處理樣品；對提取時間10、20、50、60 min的處理，進行了對比結(jié)果顯示超聲20、50、60 min芍藥苷含量沒有明顯的變化，為了節(jié)省時間，合理利用資源，試驗選擇超聲提取時間為20min。即提取方法為甲醇超聲處理20 min。

[1]張麗華,孫紅霞,李洪宇,等.宮瘤消片質(zhì)量標準研究[J].中成藥,2007,29(7):20-21.

[2]吳少華,馬云保,羅曉東,等.丹皮的化學成分研究[J].中草藥,2002,33(8):679-680.

[3]郭戎,狄留慶,謝光輝,等.HPLC法測定加味逍遙丸中丹皮酚的含量[J].中國中藥雜志,1998,23(3):156.

[4]寸時燦.HPLC法測定金匱腎氣丸中丹皮酚的含量[J].中成藥,2002,24(4):309.

[5]國家藥品監(jiān)督管理局編.《國家中成藥標準匯編》（中成藥地方標準上升國家標準部分）[C].腫瘤:兒科分冊,2002:391.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].二部.北京:化學工業(yè)出版社,2005:119.

[7]劉巖,劉順航,徐佳麗,等.HPLC同時測定廣東湯中葛根素和芍藥苷的含量[J].中成藥,2007,29(6):842-845.

[8]溫預關,陸潤基,喻凌寒.RP-HPLC-MS法測定益智合劑中芍藥苷的含量[J].中國藥房,2008,(3):199-200.