有機溶劑中脂肪酶催化辛酸辛酯的合成

張鳳秀，張光先

(1.西南大學化學化工學院，重慶 400715；2.西南大學紡織服裝學院，重慶 400715)

有機溶劑中脂肪酶催化辛酸辛酯的合成

張鳳秀1，張光先2,*

(1.西南大學化學化工學院，重慶 400715；2.西南大學紡織服裝學院，重慶 400715)

以豬胰腺脂肪酶為催化劑合成辛酸辛酯。研究有機溶劑、反應溫度、加水量、加酶量、反應時間、底物濃度及底物物質的量比7個因素對酶促酯化反應的影響，優化得到最佳合成條件。結果表明：最佳反應溫度45℃、正己烷有機溶劑、加水量29μL、酶質量濃度2.314g/L、反應時間24h、辛酸與辛醇物質的量比為1:1.2～1:1.5、辛酸濃度為0.23～0.33mol/L。在優化條件下，辛酸的轉化率達到98.12%以上，并通過IR、1H NMR、13C NMR譜表征了產物結構。酶催化法能在溫和的反應條件下合成高產率的酯。

脂肪酶；合成；辛酸辛酯；有機溶劑；酯化反應

Abstract ：The synthesis of caprylic caprylate catalyzed by lipase from porcine pancreas in an organic solvent was carried out to explore the effects of organic solvent type, reaction temperature, amount of added water, reaction time, lipase amount,substrate concentration and caprylic acid-to-caprylic alcohol ratio on caprylic acid conversion. The optimum organic solvent for caprylic caprylate synthesis was n-hexane. Reaction temperature of 45 ℃, amount of added water of 29 μ L, caprylic acid-tocaprylic alcohol ratio of 1:1.2－1:1.5, caprylic acid concentration of 0.23－0.33 mol/L, lipase concentration of 2.314 g/L were found optimum. Under these optimized conditions, the conversion ratio of caprylic acid was 98.12%. In addition, the structure of synthesized product was characterized by IR,1H NMR and13C NMR. This synthesis method can yield a high conversion ratio of caprylic acid under mild reaction conditions.

Key words：lipase；synthesis；caprylic caprylate；organic solvent；esterification

酯類化合物通常有一定的芳香味，廣泛應用于配制各種果汁、食用香精、食品添加劑及化妝品中[1-2]。在工業上，酯類化合物常采用濃硫酸為催化劑的傳統方法合成。該合成方法存在反應時間長、副反應多、產率低以及對生產設備帶來嚴重腐蝕等缺點[3]。為此，許多學者在催化劑改進方面開展較多研究工作，比如采用氨基磺酸、甲烷磺酸、芳基磺酸(鹽)(如苯磺酸和對甲苯磺酸)、樹脂以及無機鹽類(如高分子負載氯化鐵、硫酸鈦、三氯化鋁)等催化劑合成酯[4-9]。雖然這些催化劑引起的副反應及對設備的腐蝕性比濃硫酸較小，且具有良好的催化性能，但仍存在一定的腐蝕性和環境污染問題，同時催化劑的回收利用率較低。

酶作為一種生物催化劑，它具有強的專一性、高的催化效率、反應條件溫和、酶可回收利用、反應耗能低、原料要求低、產品質量高等優點，被認為是一種綠色催化劑[10-11]。因而，酶催化技術已廣泛地應用于油脂、化工、食品、化妝品等行業中[12-14]。

食用香料辛酸辛酯屬中、長碳鏈酯，其沸點高，有似玫瑰和蘑菇香氣。目前，在工業上仍然采用濃硫酸為催化劑直接酯化法合成[15]。由于該合成方法需要的酯化溫度高，這樣會導致產物和反應物炭化嚴重，產率低，且產物的分離提純需要的工藝條件較高。因此，本實驗用豬胰腺脂肪酶為催化劑合成辛酸辛酯，考察底物濃度、底物物質的量比、反應溫度、加酶量、加水量、有機溶劑和反應時間對酶催化合成辛酸辛酯的影響，探討并優化最佳反應條件，并用IR譜、1H NMR和13C NMR譜表征產物結構，以期得到辛酸辛酯高轉化率的最佳酶催化合成方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬胰腺脂肪酶(lipase from porcine pancreas TypeⅡ)美國Sigma公司；辛酸 中國醫藥上?；瘜W試劑公司；辛醇 寧波大川精細化工有限公司；以上或其他試劑均為分析純或化學純。所有試劑使用前用3A分子篩干燥24h，使其脫去水分。

1.2 儀器與設備

SHA-B恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；HH系列六孔恒溫水槽 江蘇金壇中大儀器廠；Speclmm GX型紅外光譜儀 美國PE公司；Av-300型核磁共振儀 瑞士Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 酯化反應

取100mL的帶塞三角瓶，用微量取樣槍移取一定體積的辛酸和辛醇，然后再向瓶中加入5mL有機溶劑、一定量酶粉、適量pH7.9的磷酸緩沖溶液及27mg無水硅膠組成反應體系，用帶蓋的橡膠塞子密閉。在一定溫度，120r/min旋轉振蕩反應24h或設定一定時間，取樣檢測。每組實驗設3次重復。

1.3.2 酯化反應轉化率的測定

辛酸辛酯的沸點高，采用液相色譜法測定辛酸轉化率與酸堿中和滴定法測定誤差僅在2%左右。因此，本實驗采用酸堿中和滴定法測定辛酸轉化率以表示辛酸辛酯的產率。定時吸取一定量的反應液，立即向反應瓶中加入體積比2:1的乙醇-丙酮溶劑5mL終止反應。加10mL蒸餾水稀釋，再加兩滴酚酞指示劑，用0.05mol/L標準NaOH溶液滴定直至剛好出現粉紅色為止，計算辛酸的轉化率。轉化率按式(1)計算。所得數據為3次重復實驗的平均值。

式中：V0為辛酸的初始體積/mL；144.24為辛酸的相對分子質量；0.915為辛酸的相對密度/(g/mL)；V為消耗NaOH溶液的體積/mL；c為NaOH溶液的濃度/(mol/L)。

1.3.3 產物的分離提純

收集轉化率98%以上的反應液，抽濾除去反應液中的酶粉。將濾液轉入100mL分液漏斗中，加入飽和Na2CO3溶液30mL，搖勻，靜置、分層，除去下層溶液，保留上層液。這樣連續操作2～3次，除去殘余的辛酸。然后，用二次蒸餾水充分搖勻，洗滌2～3次。上層有機相轉入100mL干燥的三角瓶中，加入適量的無水硫酸鈉，干燥。在減壓蒸餾下收集138～140℃餾分。得淺黃色辛酸辛酯純品。

1.3.4 產物表征

用紅外光譜儀(直接用辛酸辛酯液體壓膜)測定IR譜。用核磁共振儀(TMS內標，CDCl3溶劑)測定1H NMR、13C NMR譜。

2 結果與分析

2.1 底物濃度對酶促酯化反應的影響

在辛酸與辛醇物質的量比為1:1、酶質量濃度為2.314g/L、加水量29μL、正己烷溶劑、45℃反應時間24h的反應條件下，考察底物濃度對酶促酯化反應的影響，結果見表1。

表1 不同底物濃度對酶促酯化反應的影響Table 1 Effects of caprylic acid and caprylic alcohol concentrations on caprylic acid conversion

由表1可知，當辛酸、辛醇的濃度低于0.28mol/L時，酯化反應的轉化率隨底物濃度的增加而增加。而高于0.28mol/L時，則轉化率隨底物濃度的增加而降低。酯化反應是一個可逆反應，為了提高產率，通常采用增加反應物的濃度方法來實現。但對于酶催化酯化反應，已有大量研究表明底物濃度過高會出現雙底物的抑制作用[16-18]。因此，辛酸和辛醇底物濃度不宜過高，否則會起抑制作用，轉化率下降。所以底物濃度為0.23～0.33mol/L最佳。

2.2 底物物質的量比對酶促酯化反應的影響

在酶質量濃度為2.314g/L、加水量29μL、正己烷溶劑、反應溫度45℃、反應時間24h的條件下，考察底物物質的量比對酶促酯化反應的影響，結果見表2。

從表2可以看出，當辛酸濃度為0.30mol/L時，且辛酸與辛醇物質的量比為1.2:1，即辛酸過量時轉化率最低。表明辛酸對酶的抑制作用較大，這可能是因為辛酸過量，降低了反應體系的pH值，從而對酶的活性起抑制作用。當辛酸濃度為0.25mol/L時，底物辛醇過量，辛酸與辛醇物質的量比在1:1.2～1:1.5范圍，轉化率最大，達到98%以上。但辛醇的濃度繼續增加時，其物質的量比由1:1.7增加到1:3.0時，轉化率明顯遞減。因此，辛酸與辛醇的物質的量比在1:1.2～1:1.5適宜。辛酸與辛醇的物質的量比為1:1.5最佳。但在實際生產上，綜合考慮成本和經濟效益，所以選擇辛酸與辛醇的物質的量比為1:1.2為宜。

表2 底物物質的量比對酶促酯化反應的影響Table 2 Effect of caprylic acid-to-caprylic alcohol ratio on caprylic acid conversion

當辛酸濃度比辛醇過量20%時，轉化率大幅度降低；而辛醇濃度比辛酸過量20%時，轉化率不但沒有下降，反而還升高。這表明辛酸濃度對酶的催化活力影響程度比辛醇大。脂肪酶的催化活力對羧酸濃度高低更為敏感。當然，辛醇濃度太高，也直接影響酶的催化活力，使轉化率下降?？梢?，辛酸和辛醇對酶催化有雙底物抑制作用。這是因為反應過程中有可能形成一種三元絡合物酶-辛醇-辛酸，反應速率則由三元絡合物的濃度確定。只有當兩底物取合適的比例時，酶-辛醇-辛酸絡合物的濃度最大，反應速率最快，轉化率高。理論上當兩底物物質的量比為1:1時，三元絡合物的濃度最大，反應速率應最快。但本實驗體系中轉化率最高值時的酸醇物質的量比為1:1.2～1:1.5。這是因為在生成酯的過程中，存在著脂肪酸進入酶的底物結合部位并與酶形成酯化酶復合物，而辛醇接近酶的活性位點，會阻礙酯化酶復合物形成酯的關鍵步驟。

2.3 反應溫度對酶促酯化反應的影響

反應溫度對酶促酯化反應影響很大。溫度過高或過低，都會直接影響酶的催化活力。在辛酸0.25mol/L、辛醇0.30mol/L、辛酸與辛醇物質的量比為1:1.2、加水量29μL、酶質量濃度為2.314g/L、反應時間24h、正己烷溶劑的反應條件下，考察35～60℃不同溫度對酶促酯化反應的影響，結果見圖1。

由圖1可知，在低溫階段(35～45℃)，隨著反應溫度的升高轉化率逐漸增加；當反應到一個臨界溫度即最適溫度(45℃)時，酶的活力出現最佳狀態，轉化率最大。當反應溫度超過最適溫度(＞45℃)時，隨著溫度逐漸升高，轉化率呈下降趨勢；當反應溫度高于50℃時，轉化率下降幅度越來越大。這是因為酶分子的構象對反應溫度的變化十分敏感。低溫時酶分子的柔性不夠，因而催化活力不夠高。隨著溫度的逐漸升高，酶分子的柔性也逐漸增加；當增加到45℃時，酶分子的柔性達到最佳狀態，此時表現出最佳的催化活力。繼續增加溫度，酶分子的柔性增加過大，其催化活力會逐漸下降。在較高的反應溫度下，有部分酶分子出現變性現象，已經喪失了其催化能力。因而辛酸的轉化率急劇下降。由此可知，豬胰腺脂肪酶催化辛酸辛酯合成的最佳溫度為45℃。

圖1 反應溫度對酶促酯化反應的影響Fig.1 Effect of reaction temperature on caprylic acid conversion

2.4 加水量對酶促酯化反應的影響

在有機溶劑中維持脂肪酶催化活性的構象需要微量的水分，因此，在反應體系中加入一定量的水是必需的[13-14]。由于加水量的多少會直接影響酶的構象變化，從而影響酶的催化活力。在辛酸0.25mol/L、辛醇0.30mol/L，辛酸與辛醇物質的量比為1:1.2、酶質量濃度為2.314g/L、溫度為45℃、反應時間為24h、正己烷溶劑的反應條件下，考察加水量對酶促酯化反應的影響，結果見圖2。

圖2 加水量對酶促酯化反應的影響Fig.2 Effect of amount of added water on caprylic acid conversion

由圖2可知，隨反應體系加水量的遞增，辛酸的轉化率呈鐘形曲線。在10～29μL范圍，隨著加水量的增加，轉化率也隨之增加。而加水量在27～29μL范圍，酶的活力最佳，轉化率高。繼續增加水量，轉化率則呈現下降的趨勢。這是因為維持酶蛋白分子結構的幾種非共價鍵相互作用(靜電引力、范德華力、氫鍵和疏水間作用力)都與水有關。當水量低于最適水量時，酶構象過于“剛性”，失去催化活力。過多的水量會導致酶的柔性增加程度過大，引起其熱力學穩定狀態的變化，不利于維持酶分子活性的三維立體空間構象，使酶的活性下降。只有適量的水量才使酶結構的動力學“剛性”和熱力學穩定性之間達到最佳平衡點，酶的催化活性處于最佳狀態[19]。因此，本實驗中適宜的加水量為29μL。

2.5 有機溶劑對酶促酯化反應的影響

脂肪酶在有機溶劑中的活性與溶劑的疏水性大小有關[14]。有機溶劑的疏水性與酶活力之間的關系用一個參數lgP作為衡量指標。lgP表示一種有機溶劑在正辛醇-水兩相溶液中的分配系數的對數，其中P為分配系數。lgP值越大，溶劑的疏水性越高。有機介質中生物催化一般遵守以下規律[19-20]：lgP＜2的極性溶劑不適合生物催化系統；2＜1gP＜4的溶劑對酶表面水層的干擾不大；lgP＞4的溶劑不干擾酶的必需水層，酶能保持活性構象。在辛酸0.25mol/L、辛醇0.30mol/L、辛酸與辛醇物質的量比為1:1.2、酶質量濃度為2.314g/L、加水量為29μL、溫度為45℃、反應時間為24h的反應條件下，考察4種有機溶劑：苯、甲苯、正己烷、吡啶對酶酯化反應的影響，結果見圖3。

圖3 有機溶劑對酶促酯化反應的影響Fig.3 Effect of organic solvent type on caprylic acid conversion

實驗所用4種有機溶劑的疏水性大小(lgP)次序為：正己烷(lgP=3.5)＞甲苯(lgP=2.5)＞苯(lgP=2.0)＞吡啶(lgP=1.04)。正己烷的疏水性最好，而吡啶的親水最強。由圖3可以看出，酯化反應在4種溶劑中辛酸的轉化率由高到低的次序為：正己烷＞甲苯＞苯＞吡啶。這與溶劑的疏水性大小一致。這可能是由于吡啶溶劑親水性較強，易剝奪酶分子表面的必需水層，使酶容易失活。而疏水性強的正己烷溶劑不會干擾酶分子表面的必需水層，也不會干擾底物向酶表面擴散，從而使脂肪酶很好地發揮催化作用。

2.6 反應時間對酶促酯化反應的影響

在辛酸0.25mol/L、辛醇0.30mol/L、辛酸與辛醇物質的量比為1:1.2、酶質量濃度為2.314g/L、溫度為45℃、加水量為29μL、正己烷溶劑的反應條件下，一定時間取樣測定轉化率，得酯化反應轉化率隨反應時間的變化曲線，結果見圖4。

圖4 反應時間對酶促酯化反應的影響Fig.4 Effect of reaction time on caprylic acid conversion

從圖4可以看出，在反應10h內，隨著時間的增加，反應速度加快，轉化率幾乎成呈線性上升。在反應10h時，轉化率已達到82.38%。10h以后，反應速度開始減慢，轉化率提高幅度不大。在反應24h，其轉化率為97.8%。24h以后，轉化率幾乎沒有提高。這是因為酯化反應是一個可逆反應，在反應開始時(10h內)，由于反應物的濃度高，正反應速度加快，轉化率大幅度提高。當反應到達一定時間(10h)以后，隨著產物酯濃度的增加，正反應速度逐漸減小，而逆反應速度逐漸增大，轉化率提高幅度不大。在24h以后酯化反應基本達到動態平衡，因此轉化率提高幅度更小。所以反應時間確定24h為宜。

2.7 加酶量對酶促酯化反應的影響

在辛酸0.25mol/L、辛醇0.30mol/L、辛酸與辛醇物質的量比為1:1.2、溫度為45℃、加水量為29μL、反應時間為24h、正己烷溶劑的反應條件下，考察不同加酶量對酯化反應的影響，結果見圖5。

圖5 不同加酶量對酯化反應的影響Fig.5 Effects of lipase amount on esterification

由圖5可以看出，當酶質量濃度較低(低于2.314g/L)時，隨著酶質量濃度的增加，轉化率逐漸增高。在酶質量濃度為2.314g/L時的轉化率達到最大。繼續增加酶質量濃度，其轉化率幾乎沒有增加。這是因為在反應體系中酶以酶-底物絡合物的形式存在。當酶質量濃度較低時，這種酶-底物絡合物的質量濃度不高，因此辛酸的轉化率不高。隨著酶質量濃度的增加，酶-底物絡合物的質量濃度增加，其轉化率也增加。而酶質量濃度過高，則過剩的酶沒有被充分利用，導致酶浪費，所以酶質量濃度為2.314g/L為宜。

2.8 產物結構表征

產物經分離提純后，分別經過紅外光譜(IR)、核磁共振氫譜(1H NMR)和核磁共振碳譜(13C NMR)表征，見圖6～8。

圖6 產物的紅外吸收光譜Fig.6 IR spectrum of the synthesized product

由圖6可知，在3600cm-1附近沒有辛醇的羥基(—OH)特征吸收峰，同時在1680cm-1與3200cm-1附近也沒有辛酸的羰基(C＝O)及羥基(—OH)的特征吸收峰，可以判斷辛酸、辛醇已經被除去。在2856.57～2958.41cm-1處出現甲基(—CH3)和亞甲基(—CH2)的強伸縮振動吸收峰，并在1378.58～1464.74cm-1出現甲基(—CH3)和亞甲基(—CH2)碳氫鍵(C—H)的彎曲振動峰；723.98cm-1為亞甲基(—CH2)面內搖擺振動峰。在1739.74cm-1處出現飽和脂肪酸酯羰基(C＝O)的強伸縮振動吸收峰，并在1106.22～1299.95cm-1處出現脂肪酯碳氧鍵(C—O)的強伸縮吸收峰，這個區域的吸收峰又與亞甲基(—CH2)的彎曲振動峰重合。因此，可以判斷產物是酯類化合物。

IR譜從產物結構基團角度，確認產物有酯基、甲基和亞甲基的存在。為了進一步確認產物的結構，通過測定1H NMR譜和13C NMR譜來確定產物中氫原子、碳原子的種類和個數。其1H NMR譜和13C NMR譜圖的結果見圖7、8。

由圖7、8可以得到產物中各種氫原子和碳原子的化學位移(δ)，其數據如下：1H NMR(CDCl3，300MHz)δ：0.86～0.88(d, J=6.28Hz, 6H, 2CH3)；1.28 (s, 18H,9CH2)；1.594～1.638(t, J=6.52Hz, 4H, 2CH2)；2.265～2.316(t, J=6.79Hz, 2H, CH2)；4.034～4.079(t, J=7.13Hz, 2H,CH2)。13C NMR(CDCl3，300MHz)δ：14.05、14.07、22.59、22.65、25.03、25.9、28.64、28.93、29.11、29.18、29.20、31.66、31.77、34.41、64.39、172.9。

圖7 產物核磁共振氫譜(1H NMR)Fig.71H NMR spectrum of the synthesized product

圖8 產物核磁共振碳譜(13C NMR)Fig.813C NMR spectrum of the synthesized product

根據1H NMR、13C NMR數據分析，可以推測出產物結構及相關數據歸屬，結果見圖9。

圖9 產物的結構式及1H NMR、13C NMR譜數據歸屬Fig.9 Structure of the synthesized product and1H NMR and13C NMR spectral assignment

通過IR、1H NMR、13C NMR譜表征，證實了辛酸辛酯產物的結構。

3 結 論

采用豬胰腺脂肪酶催化辛酸與辛醇的酯化反應，優化得到最佳反應條件：正己烷溶劑、反應溫度45℃、加水量29μL、酶質量濃度2.314g/L、反應時間24h、辛酸濃度為0.23～0.33mol/L、辛酸與辛醇的物質的量比為1:1.2～1:1.5。在優化條件下，辛酸的轉化率達到98.12%以上，并通過IR、1H NMR、13C NMR譜表征了產物結構。酶催化法能在溫和的反應條件下合成得到高產率的酯，可為中、長碳鏈的生物合成實現工業化生產提供一定的實驗依據。

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Enzymatic Synthesis of Caprylic Caprylate in an Organic Solvent

ZHANG Feng-xiu1，ZHANG Guang-xian2,*
(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, Southwest University, Chongqing 400715, China；2. College of Textile and Garment, Southwest University, Chongqing 400715, China)

TS225 3

A

1002-6630(2010)15-0044-06

2009-12-23

重慶市科委自然基金項目(CSTC，2008BB4250)；西南大學博士基金項目(swu109052)

張鳳秀(1965—)，女，副教授，博士，研究方向為生物有機合成。E-mail：zhangfx656472@sina.com

*通信作者：張光先(1965—)，男，教授，博士，研究方向為生物有機合成。E-mail：zgx656472@sina.com