豬胰脂肪酶水解花椒籽油動(dòng)力學(xué)及條件優(yōu)化

徐懷德，唐 菊，劉立芳

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

豬胰脂肪酶水解花椒籽油動(dòng)力學(xué)及條件優(yōu)化

徐懷德，唐 菊，劉立芳

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

為開發(fā)花椒籽油中的α-亞麻酸，對(duì)豬胰脂肪酶水解花椒籽油的酶解特性和水解條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明：油水界面面積(αt)與溫度(t)、攪拌速率(ω)、底物濃度(S)的關(guān)系為αt=0.04ω0.577t1.242S(1+0.02S)。水解反應(yīng)速率隨溫度的變化服從Arrhenius方程，反應(yīng)活化能為21.891kJ/mol。以米氏方程為理論基礎(chǔ)，考慮αt對(duì)水解反應(yīng)速率的影響，建立豬胰脂肪酶對(duì)花椒籽油的水解動(dòng)力學(xué)模型。豬胰脂肪酶水解花椒籽油的適宜條件為：溫度50℃、油質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、酶質(zhì)量濃度72.9g/L，在此條件下反應(yīng)4h后水解率達(dá)57.13%。

豬胰脂肪酶；花椒籽油；水解；動(dòng)力學(xué)；條件優(yōu)化

Abstract ：In order to exploit α-linolenic acid from prickly ash seed oil, the hydrolysis characteristics of prickly ash seed oil by porcine pancreatic lipase were investigated and some key hydrolysis conditions were explored. The results indicated that an equation expressing oil-water interface (α t) with respect to reaction temperature (t), agitation speed (ω) and substrate concentration (S) was developed as follows: αt= 0.04ω0.577t1.242S (1 + 0.02S). The change in hydrolysis reaction rate with varying reaction temperature obeyed Arrhenius equation. The activation energy was 21.891 kJ/mol. Based on Michaelis-Menten equation and the effect of αt on reaction rate, a kinetic model was established to describe the hydrolysis of prickly ash seed oil by porcine pancreatic lipase. The optimal hydrolysis conditions of prickly ash seed oil by porcine pancreatic lipase were reaction temperature of 50 ℃, oil concentration of 30%, enzyme concentration of 72.9 g/L and reaction time of 4 h. The dgree of hydrolysis reached up to 57.13% under these optimal conditions.

Key words：porcine pancreatic lipase；prickly ash seed oil；hydrolysis；kinetic；condition optimization

花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim)被譽(yù)為我國(guó)“八大調(diào)味品”之一，目前在我國(guó)種植面積達(dá)80萬hm2。花椒籽是花椒生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，我國(guó)每年約有30～40萬t的花椒籽油亟待開發(fā)利用[1-2]。花椒籽油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)80%，其中亞油酸含量為25%～32%，α-亞麻酸含量為17%～24%[3]，是極具開發(fā)潛力的油脂資源。α-亞麻酸是重要的醫(yī)藥、保健食品原料，具有抗炎癥、抗血栓、抗心率失常、降血脂、改善血管彈性的作用，還具有調(diào)節(jié)中央神經(jīng)系統(tǒng)、提高記憶力的功能，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)需求空間。花椒籽油的深度開發(fā)利用對(duì)提高花椒的種植效益、改善生態(tài)環(huán)境等具有重要意義。

近年來，花椒籽油主要用于生產(chǎn)油漆、制造肥皂、制備生物柴油，也有采用尿素包合法和色譜法分離純化花椒籽油中的α-亞麻酸[2-3]。脂肪酸制備方法有酸水解法、皂化-酸水解法和酶催化水解法[4]，酸水解法效率較低，皂化-酸水解法得到的產(chǎn)品顏色深，副產(chǎn)物多，為后續(xù)分離純化帶來很大困難。脂肪酶水解油脂制備脂肪酸具有條件溫和、產(chǎn)品質(zhì)量好、能耗低和環(huán)境污染小等優(yōu)勢(shì)，目前酶法已成為通過油脂生產(chǎn)脂肪酸的主要方法[5-6]。酶解亞麻油、魚油、棕櫚油、紫蘇子油等制備脂肪酸的研究報(bào)道較多，但多數(shù)研究只停留在酶解條件的優(yōu)化[7-10]。國(guó)外Okada 等[11]、Sulaiman等[12]對(duì)脂肪酶的酶解特性進(jìn)行了研究，建立了脂肪酶催化油脂水解的動(dòng)力學(xué)模型。而國(guó)內(nèi)相關(guān)研究的報(bào)道較少，對(duì)酶解花椒籽油制備脂肪酸的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)選用豬胰脂肪酶水解花椒籽油，研究其水解動(dòng)力學(xué)特性，并對(duì)水解條件進(jìn)行優(yōu)化，以為花椒籽油及α-亞麻酸的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽油(平均相對(duì)分子質(zhì)量為886) 陜西省韓城市金太陽花椒油脂藥料有限責(zé)任公司。

豬胰脂肪酶(比活力8000U/g) 諾維信投資有限公司；KOH 天津市化學(xué)試劑廠；Na2HPO4、NaH2PO4天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司；酚酞指示劑 武漢市中天化工有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DMBA-400數(shù)碼顯微鏡 廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司；MP200B電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠；HJ-4A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器 金壇市杰爾瑞電器有限公司；KDC-40離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司偉佳分公司。

1.3 方法

1.3.1 水解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

用0.05mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH7.0)將豬胰脂肪酶配制成20U/mL酶液。將酶液及花椒籽油分別預(yù)熱至水解溫度后混合，在磁力攪拌器中恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)20min，取出后于沸水浴中滅酶15min。將水解產(chǎn)物離心，吸取2mL上層油相，用0.01mol/L KOH滴定，重復(fù)兩次取平均值[13]。水解反應(yīng)速率(υ)按式(1)計(jì)算[14]。

式中：V1為反應(yīng)后樣品消耗的KOH體積/mL；V0為反應(yīng)前樣品消耗的KOH體積/mL；c為KOH濃度/(mol/L)；Vs為樣品的體積/mL；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.2 油水界面面積(αt)的測(cè)定[15]

稱取花椒籽油于三角瓶中，按實(shí)驗(yàn)預(yù)定的比例加入蒸餾水，在磁力攪拌器中恒溫?cái)嚢?0min，吸取1滴樣品于載玻片上，立即用顯微鏡測(cè)定分散在水相中的油滴粒徑，每個(gè)樣品測(cè)定200個(gè)油滴。將粒徑按大小分為3組：小于10μm、10～20μm、20～30μm。按公式(2)計(jì)算平均粒徑。

式中：D0為油滴平均粒徑/m；i為測(cè)定油滴個(gè)數(shù)；j為粒徑組數(shù)；di為第i個(gè)油滴的粒徑/μm；θj為第j組油滴的個(gè)數(shù)在所測(cè)油滴總數(shù)中占的比例。

方程(3)為Calderbank[16]建立的油水界面面積與溫度(t)、攪拌速率(ω)、底物濃度(S)的關(guān)系式：

式中：αt為油水界面面積/m-1；φ為油與反應(yīng)體系的體積比；S為底物濃度/(mol/L)；t為溫度/℃；ω為攪拌速率/(r/min)；α、m、k、n為常數(shù)。

1.3.3 中心組合試驗(yàn)[17]

稱取豬胰脂肪酶于磨口三角瓶中，用0.05mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH7.0)將其溶解，按比例加入花椒籽油，在恒溫磁力攪拌器中恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇攪拌速率為300r/min，反應(yīng)時(shí)間為4h。以油質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溫度、酶質(zhì)量濃度為試驗(yàn)因子，以水解率為響應(yīng)值，采用中心組合試驗(yàn)優(yōu)化豬胰脂肪酶水解花椒籽油的條件。水解率按公式(4)計(jì)算。

式中：AV0、AV分別為水解前后花椒籽油的酸價(jià)，水解前酸價(jià)(以KOH計(jì))，1.93mg/g；SV為水解前花椒籽油皂化值(以KOH計(jì))，190mg/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件對(duì)油水界面面積的影響

2.1.1 底物濃度對(duì)油水界面面積的影響

磁力攪拌器中恒溫40℃攪拌30min。攪拌速率和底物濃度對(duì)油水界面面積的影響如圖1所示。

圖1 底物濃度和攪拌速率對(duì)油水界面面積的影響Fig. 1 Effect of substrate concentration and agitation speed onαt

由圖1可知，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，隨著攪拌速率的加快，油水界面面積增大；當(dāng)攪拌速率一定時(shí)，隨著底物濃度的升高，油水界面面積增大。在底物濃度低于113mol/L時(shí)，油水界面面積的增速較快，底物濃度高于113mol/L時(shí)，油水界面面積的增速逐漸變緩。

2.1.2 溫度對(duì)油滴平均粒徑的影響

當(dāng)?shù)孜餄舛葹?13mol/L時(shí)，磁力攪拌器中攪拌30min，攪拌速率和溫度對(duì)油滴平均粒徑的影響如圖2所示。

圖2 溫度和攪拌速率對(duì)油滴平均粒徑的影響Fig.2 Effect of reaction temperature and agitation speed on the average diameter of oil droplets

由圖2可見，隨著攪拌速率和溫度的升高，油滴平均粒徑減小。

用方程(3)對(duì)圖1和圖2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，采用DPS軟件估計(jì)模型參數(shù)，得到αt與t、ω及S的關(guān)系式：

統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)r=0.974，說明模型(3)對(duì)本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合是極顯著的。

2.2 反應(yīng)條件對(duì)反應(yīng)速率的影響

2.2.1 底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響

酶質(zhì)量濃度為30000g/L，溫度40℃時(shí)，攪拌速率和底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響見圖3。

圖3 底物濃度和攪拌速率對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration and agitation speed on reaction rate

由圖3可見，隨著底物濃度和攪拌速率的增大，反應(yīng)速率上升。在同一攪拌速率下，底物濃度增加，油水界面面積增大，引起反應(yīng)速率增大。當(dāng)?shù)孜餄舛雀哂?24mol/L時(shí)，反應(yīng)速率緩慢下降。

2.2.2 酶質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響

底物濃度為113mol/L，溫度40℃時(shí)，攪拌速率和酶質(zhì)量濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響見圖4。

圖4 酶質(zhì)量濃度和攪拌速率對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.4 Effect of enzyme concentration and agitation speed on reaction rate

由圖4可知，當(dāng)酶質(zhì)量濃度低于825g/L時(shí)，反應(yīng)速率與酶質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系；酶質(zhì)量濃度高于825g/L時(shí)，隨酶質(zhì)量濃度的增大，反應(yīng)速率增速逐漸變緩。另外，攪拌速率加快，油水界面面積增大，酶與底物接觸的機(jī)會(huì)增多，則酶在油水界面上達(dá)到飽和時(shí)所需的酶量增多。

2.2.3 溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響

底物濃度250mol/L，酶質(zhì)量濃度250g/L，攪拌速率300r/min條件下，在溫度分別為30、35、40、45、50、60、70℃時(shí)進(jìn)行水解反應(yīng)，溫度與反應(yīng)速率的關(guān)系見圖5。

圖5 溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on reaction rate

圖5中的曲線是一條鐘罩形曲線，即溫度從30℃增加到50℃，反應(yīng)速率增至最大，以后隨著溫度升高，反應(yīng)速率迅速下降。

圖6 lnν與1/T關(guān)系圖Fig.6 Relationship between lnνand l/T

將lnν與1/T作圖，得到如圖6的直線，可見溫度在303～323K范圍內(nèi)時(shí)，lnν與1/T之間呈線性關(guān)系，表明水解反應(yīng)速率隨溫度的變化服從Arrhenius方程[7]：

式中：B為積分常數(shù)；R為氣體常數(shù)/(J/(mol·K))；Ea為活化能/(kJ/mol)；T為熱力學(xué)溫度/K。

圖6中直線斜率為－Ea/2.303R，由斜率可求出Ea為21.891kJ/mol。

2.3 動(dòng)力學(xué)模型的建立及檢驗(yàn)

2.3.1 動(dòng)力學(xué)模型的建立[17-18]

在無有機(jī)溶劑的體系中，脂肪酶催化油脂水解反應(yīng)發(fā)生在油水界面，脂肪酶催化油脂水解的過程分為3步，首先是脂肪酶通過滲透作用進(jìn)入油水界面中，形成中間體E*；然后中間體E*與底物形成E*S復(fù)合物；最后分解成產(chǎn)物P，反應(yīng)方程式見式(7)、(8)：

由方程(7)和(8)推導(dǎo)出脂肪酶催化油脂水解的反應(yīng)速率方程(9)：

式中：kcat為催化速率常數(shù)/min-1；Am為酶在油水界面占的面積；S為底物濃度/(mol/L)；ke為平衡常數(shù)/(mol/L)；kp、kd分別為吸附和解析常數(shù)(單位為1)；Et為酶質(zhì)量濃度/(g/L)。

用方程(9)對(duì)圖5和圖6中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，通過DPS軟件分析，相關(guān)系數(shù)r為0.966，模型的參數(shù)見表1。

表1 模型參數(shù)Table 1 Parameters of the established hydrolysis kinetic model

將表1中參數(shù)代入方程(9)，得到豬胰脂肪酶水解花椒籽油的動(dòng)力學(xué)模型為：

2.3.2 模型檢驗(yàn)

取酶質(zhì)量濃度500g/L和2500g/L高低兩個(gè)梯度，底物濃度分別為50、100、150、200、250、300、350、400mol/L，按照1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)。圖7為模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的比較，模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值吻合較好，因此可用該模型來描述豬胰脂肪酶水解花椒籽油的過程。

圖7 模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值的比較Fig.7 Comparison of predicted and experimental values of hydrolysis reaction rate at different enzyme concentrations

2.4 中心組合試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝條件

中心組合設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。以水解率(DH)為固定變量(Y)，以溫度(x1)、油質(zhì)量分?jǐn)?shù)(x2)、酶質(zhì)量濃度(x3)為因變量，經(jīng)Design-Expert7.0統(tǒng)計(jì)分析得到的數(shù)學(xué)模型為：

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of central composite experiments

2.4.1 回歸模型的檢驗(yàn)

表3 回歸方程顯著性檢驗(yàn)Table 3 Variance analysis for the developed regression equation

由表3回歸模型的方差分析可知，回歸模型的失擬性檢驗(yàn)F＝1.33＜F0.05(5,5)＝5.05，不顯著，可以認(rèn)為所選用的回歸模型是適合的。模型P＝0.0001＜0.01，表明模型極顯著，復(fù)相關(guān)系數(shù)R＝0.93，說明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值吻合較好，模型具有實(shí)際意義。

表4 數(shù)學(xué)模型的回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Regression coefficients of developed regression equation and corresponding variance analysis

由表4可知，一次項(xiàng)x1(P＝0.01)、x2(P＜0.0001)、x3(P=0.0001)和二次項(xiàng)x32(P＝0.0003)均達(dá)到極顯著水平；x12(P＜0.05)、x22(P＜0.05)達(dá)到顯著水平。各因素對(duì)水解度的影響次序依次為x2＞x3＞x1，即油質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶質(zhì)量濃度＞溫度。

2.4.2 酶解工藝參數(shù)的優(yōu)化

采用Design-Expert7.0統(tǒng)計(jì)軟件優(yōu)化得到豬胰脂肪酶水解花椒籽油的最適反應(yīng)條件為：溫度50℃、油質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、酶質(zhì)量濃度72.9g/L，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)4h水解率為57.13%，與預(yù)測(cè)值54.97%接近，擬和性好，表明了模型的有效性。

3 結(jié) 論

3.1 油水界面面積(αt)與溫度(t)、攪拌速率(ω)、底物濃度(S)的關(guān)系為：αt=0.04ω0.577t1.242S(1+0.02S)。酶解反應(yīng)速率隨溫度的變化服從Arrhenius方程，活化能Ea＝21.891kJ/mol。

3.2 在米氏方程基礎(chǔ)上，考慮αt的影響，建立的豬胰脂肪酶水解花椒籽油的動(dòng)力學(xué)模型為：

此模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)性較好，可用于描述豬胰脂肪酶水解花椒籽油的動(dòng)力學(xué)過程。

3.3 豬胰脂肪酶水解花椒籽油的二次回歸數(shù)學(xué)模型為Y =41.51＋3.42x1－7.8x2＋7.17x3－2.43x21＋2.29x22－6.31x32－1.3x1x2＋0.16x1x3＋2.04x2x3，適宜的酶解條件為溫度50℃、油質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、酶質(zhì)量濃度72.9g/L，在此條件下反應(yīng)4h后水解率達(dá)57.13%，各因素對(duì)花椒籽油水解的影響順序?yàn)椋河唾|(zhì)量分?jǐn)?shù)＞酶質(zhì)量濃度＞溫度。

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Kinetics and Optimization of Porcine Pancreatic Lipase-catalyzed Hydrolysis of Prickly Ash Seed Oil

XU Huai-de，TANG Ju，LIU Li-fang
(College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China)

Q556.1

A

1002-6630(2010)15-0055-05

2009-10-19

陜西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)課題(2007K01-10-2)

徐懷德(1964—)，男，副教授，本科，主要從事軟飲料、果品蔬菜貯藏與加工、天然產(chǎn)物提取研究。E-mail：xuhuaide@yahoo.com.cn