雙孢蘑菇多酚氧化酶交聯作用對酪蛋白乳化性及其穩定性的影響

吳進菊，高金燕，劉 瀟，程 偉，陳紅兵,*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330047)

雙孢蘑菇多酚氧化酶交聯作用對酪蛋白乳化性及其穩定性的影響

吳進菊1,2，高金燕1,3，劉 瀟1,2，程 偉1,2，陳紅兵1,2,*

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330047)

利用雙孢蘑菇多酚氧化酶(PPO)對酪蛋白進行交聯，考察交聯后酪蛋白乳化性和乳化穩定性，并采用SDSPAGE電泳檢測交聯物的形成情況。結果表明：當PPO酶比活力為400U/mL，25℃反應4h時，交聯后的酪蛋白乳化性和乳化穩定性分別為18.3m2/g和19.8min，較未交聯的酪蛋白乳化性和乳化穩定性分別提高了17.3%和37.5%。交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性得到顯著提高，并且與形成的聚合物含量有著密切的關系。

雙孢蘑菇多酚氧化酶；酪蛋白；交聯；乳化性；穩定性

Abstract：Cross-linking of food proteins can modify their functional properties. Casein was cross-linked by polyphenol oxidase from Agaricus bisporus. The emulsifying capacity and emulsion stability of cross-linked casein were analyzed and SDS-PAGE was used to detect the amount of polymer formation. The emulsifying capacity and emulsion stability of cross-linked casein obtained after polyphenol oxidase treatment at 25 ℃ and an enzyme concentration of 400 U/mL for 4 h were 18.3 m2/g and 19.8 min, 17.3% and 37.5% higher than those of non-cross-linked casein, respectively. Such significant increments in both emulsifying properties might be tightly related to the amount of formed cross-linked casein.

Key words：Agaricus bisporus polyphenol oxidase；casein；cross-linking；emulsifying capacity；emulsion stability

對食物蛋白進行交聯，可改善蛋白質的功能特性，如熱穩定性、乳化性、凝膠特性、保水性、流變學特性等[1]。近年來，利用酶對蛋白進行交聯引起了學者的廣泛關注。可用于蛋白交聯的酶主要有轉谷氨酰胺酶、過氧化酶、多酚氧化酶等，它們可催化蛋白質形成分子內或分子間交聯[1]。目前，研究最多和最深入的是轉谷氨酰胺酶的交聯作用[2-3]，而多酚氧化酶對蛋白的交聯作用研究相對較少。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO，EC 1.14.18.1) 是一種含銅金屬酶，普遍存在于各種植物、真菌和昆蟲中。國外學者研究發現，PPO能催化多種蛋白發生交聯反應，如小麥醇溶蛋白[4]、α-乳白蛋白[5]、β-乳球蛋白[5]、溶菌酶[5]、蚌類蛋白[6]、原膠原蛋白[7]、β-酪蛋白[8]和麩質[9]等，但是暫未發現對牛乳中全部酪蛋白進行交聯的研究。目前，國內尚未見PPO交聯食物蛋白方面的報道。本實驗采用雙孢蘑菇多酚氧化酶對酪蛋白進行交聯，研究了PPO酶比活力、反應溫度和時間對酪蛋白交聯后乳化性和乳化穩定性的影響，旨在通過交聯反應改善酪蛋白的乳化性和乳化穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮牛奶 江西南昌陽光乳業有限公司；咖啡酸Sigma-aldrich公司；鄰苯二酚、丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Allegra 64R 高速冷凍離心機 美國Backman公司；中空纖維超濾器 北京市宣武超濾設備廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；FJ-200 高速分散均質機 上海標本模型廠；PB-10 型酸度計 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的制備

將鮮牛奶脫脂后用1mol/L HCl調pH值至4.6，40℃保溫30min沉淀酪蛋白，將酪蛋白冷凍干燥后4℃保存備用。稱取酪蛋白2g，加入0.1mol/L NaOH 20mL，60℃溶解后用0.1mol/L HCl調整溶液的pH值為7.0，最后用蒸餾水定容到100mL，即得0.02g/mL酪蛋白溶液。

1.3.2 PPO粗酶液的制備

將從市場上買來的新鮮雙孢蘑菇去皮、切碎，放入研缽中，加入液氮，迅速用杵搗碎至無明顯顆粒的粉末狀。加入預冷丙酮(－20℃)，用布氏漏斗進行抽濾，然后進行真空冷凍干燥，即得丙酮粉，－20℃保存備用。取冷凍干燥丙酮粉0.2g，加入10mL預冷(4℃)的0.05mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液，磁力攪拌25～30min，7000r/min離心20min，上清液即為粗酶液[10]。

1.3.3 PPO交聯對酪蛋白功能特性影響的實驗方案

反應體系為1g/mL酪蛋白溶液，在酪蛋白溶液中加入100mmol/L咖啡酸使其終濃度為1mmol/L，然后加入PPO粗酶液，使酶與溶液比分別達到200、400、600、800U/mL和1000U/mL，最后補充蒸餾水使酪蛋白溶液終質量濃度為0.01g/mL，混勻，15～35℃分別反應1～8h后，80℃加熱5min停止反應。冷卻至室溫后測定蛋白的乳化性和乳化穩定性，對照不加酶液。

1.3.4 酪蛋白乳化性和乳化穩定性的測定

反應條件同1.3.3節，結束后立即測定溶液的乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)。采用Liu等[11]的方法并稍有改變：取反應混合物10mL，加入大豆色拉油3mL，然后以10000r/min高速均質2min，立即或10min后用微量吸液器從底部抽取乳狀液10μL，與5mL 0.1% SDS混合，在分光光度計上500nm波長處測其吸光度。EAI(m2/g)和ESI (min)采用如下公式進行計算：

式中：T為2.303；C為乳化液形成前蛋白質水溶液中蛋白質量濃度/(g/mL)；φ為乳化液中油的體積分數；A0為均質后迅速被稀釋的乳化液的吸光度；A10min為乳化液在靜止10min后的吸光度；t為時間(本實驗是10min)。

1.3.5 PPO酶比活力測定

參照Gawlik-Dziki[12]等的方法，用0.05mol/L、pH7.0磷酸鹽緩沖液配制0.04mol/L鄰苯二酚溶液，取2.8mL鄰苯二酚溶液，加入0.2mL粗酶液，混勻后在420nm波長處比色，酶液加入后開始計時，每30s記錄1次OD420nm隨時間的變化值，以最初直線段的斜率計算酶比活力。一個酶活力單位定義為在測定條件下，每分鐘引起光密度值改變0.001所需的酶量。

1.3.6 交聯聚合物的SDS-PAGE電泳檢測[13]

在酪蛋白溶液中加入100mmol/L咖啡酸使其終濃度為1mmol/L，然后加入PPO粗酶液，使酶與溶液比為400U/mL，最后補充蒸餾水使酪蛋白溶液終濃度為0.01g/mL，混勻，25℃分別反應1～8h后，80℃加熱5min停止反應。取10μL樣品加入等體積的上樣緩沖液，煮沸3～5min后取4μL上樣。采用5%的濃縮膠和15%的分離膠，濃縮膠中10mA 電泳20min，分離膠中30mA電泳50min左右。電泳完畢采用Quantity One軟件對蛋白條帶進行光密度掃描分析，對蛋白質含量進行相對定量。

蛋白條帶相對含量=條帶的平均光密度(OD)×條帶面積/mm2。

2 結果與分析

2.1 PPO酶比活力對交聯后酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

表1 PPO酶比活力對交聯后酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Table 1 Effect of PPO activity on emulsifying activity and emulsion stability of cross-linked casein

由表1可知，交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性較對照組均有所提高。當酶比活力為400U/mL和800U/mL時，酪蛋白乳化性相對較高，分別為13.6m2/g和14.2m2/g，對照組僅為11.5m2/g。當酶比活力為600U/mL時，酪蛋白乳化穩定性最高，達到了18.8min，其次為酶比活力為200U/mL和1000U/mL時，酪蛋白的乳化穩定性分別為18.1min和18.2min，而對照組為15.5min。

2.2 反應溫度對交聯后酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

圖1 反應溫度對交聯后酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Fig.1 Effect of temperature on emulsifying activity and emulsion stability of cross-linked casein

由圖1可知，在15～35℃的范圍內，交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性均比對照組高。反應溫度對交聯后酪蛋白乳化性的影響不太明顯。反應溫度為30℃時酪蛋白乳化性最小，為19.0m2/g，其他反應溫度下酪蛋白乳化性變化較小，均在20.5m2/g左右，而對照組酪蛋白的乳化性僅為16.8m2/g。反應溫度在15～25℃的范圍內，隨著溫度的升高，酪蛋白的乳化穩定性逐漸升高，25℃時達到最高，為32.9min。當反應溫度高于25℃時，酪蛋白的乳化穩定性隨著溫度的升高而降低，35℃時僅為20.6min，但仍比對照組(15.1min)高很多。

2.3 反應時間對交聯后酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

圖2 反應時間對交聯后酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響Fig.2 Effect of incubation time on emulsifying activity and emulsion stability of cross-linked casein

將反應混合物置于25℃分別反應1、2、4、6h和8h，考察反應時間對交聯后酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響，結果如圖2所示。反應時間在1～4h范圍內，隨著時間的增加，酪蛋白乳化性也隨之增加，在4h時達到最高，為18.3m2/g；而在4～8h內，酪蛋白的乳化性先減小后增加，但交聯后酪蛋白的乳化性均比交聯前高。在1～8h范圍內，酪蛋白的乳化穩定性隨著反應時間的增加而減少。反應1h的酪蛋白乳化穩定性最高，達到了22.0min，而反應8h的酪蛋白乳化穩定性最小，為16.7min。

因此，當PPO酶比活力為400U/mL、25℃反應4h時，交聯后的酪蛋白乳化性和乳化穩定性分別為18.3m2/g和19.8min，與未交聯的酪蛋白相比較，乳化性和乳化穩定性分別提高了17.3%和37.5%。另外，通過t檢驗可知，在此反應條件下，交聯前后酪蛋白的乳化性差異顯著(P＜0.05)，乳化穩定性差異極顯著(P ＜0.01)。

2.4 聚合物含量對酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

采用SDS-PAGE電泳觀察反應時間對酪蛋白交聯的影響(圖3)，并對聚合物進行光密度掃描分析，結果如圖4所示。在1～4h范圍內，隨著反應時間的延長，酪蛋白相對含量逐漸減少，聚合物相對含量逐漸增多。而在4～8h范圍內，隨著反應時間的延長，酪蛋白含量和聚合物含量反而有所降低。而從2.3節分析中可知，在相同的交聯條件下，反應時間在1～4h范圍內，隨著時間的增加，酪蛋白乳化性也隨之增加，在4～8h內，酪蛋白的乳化性呈先減小后增加的趨勢，而酪蛋白的乳化穩定性在1～8h范圍內隨著反應時間的增加而減少。由此可知，交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性與形成的聚合物的含量有著密切的關系，但并不是一個簡單的線性關系。

圖3 反應時間對酪蛋白交聯的影響Fig.3 Effect of incubation time on cross linking of casein

圖4 反應時間對酪蛋白和聚合物相對含量的影響Fig.4 Effect of incubation time on casein and polymer formation

3 結 論

通過調節PPO酶比活力、反應溫度和時間，可以提高交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性。當PPO酶比活力為400U/mL，25℃反應4h時，交聯后的酪蛋白乳化性和乳化穩定性分別為18.3m2/g和19.8min，較未交聯的酪蛋白乳化性和乳化穩定性分別提高了17.3%和37.5%，并且交聯后酪蛋白的乳化性和乳化穩定性與形成的聚合物的含量有著密切的關系。

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Emulsify Capacity and Stability of Cross-linked Casein with Polyphenol Oxidase from Agaricus bisporus

WU Jin-ju1,2，GAO Jin-yan1,3，LIU Xiao1,2，CHENG Wei1,2，CHEN Hong-bing1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

TQ93

A

1002-6630(2010)15-0117-04

2010-04-22

國家“863”計劃項目(2006AA10Z324)；江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ09063)；江西省研究生創新資金項目

吳進菊(1983—)，女，博士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：wujinju302@163.com

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：chbgjy@hotmail.com