表沒食子兒茶素沒食子酸酯的甲基化分子修飾

呂海鵬，孫業良，林 智*，譚俊峰，郭 麗

(中國農業科學院茶葉研究所，茶葉加工工程研究中心，浙江 杭州 310008)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯的甲基化分子修飾

呂海鵬，孫業良，林 智*，譚俊峰，郭 麗

(中國農業科學院茶葉研究所，茶葉加工工程研究中心，浙江 杭州 310008)

研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的甲基化分子修飾。以碘甲烷作為甲基供體，采用化學合成方法研究EGCG的甲基化分子修飾，并通過HPLC-MS和NMR等對反應產物進行結構鑒定。結果表明：采用化學合成方法能有效完成EGCG的甲基化分子修飾，并分離鑒定出5個EGCG甲基化衍生物，分別為4″-Me-EGCG、4′,4″-di-Me-EGCG、5,3′,4′,5′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG、5,7,3′,4′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG、5,7,3′,4′,5′,3″,4″,5″-octa-Me-EGCG。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；甲基化；分子修飾；碘甲烷；化學合成

Abstract ：For EGCG methylation via chemosynthesis, methyl iodide was used as methyl donor and two reaction systems (No.1 and No.2) were designed, in which the molar ratios between EGCG and methyl iodide were set at 1:80 and 1:1, respectively.Reaction products TRI-1 and TRI-2 obtained from reaction system No.1 and No.2, respectively were characterized by HPLCMS and NMR. The results showed that the molecular modification of EGCG could be successfully accomplished by the use of chemosynthesis, and five EGCG derivatives, namely 4″-Me-EGCG, 4′,4″-di-Me-EGCG, 5,3′,4′,5′,3″,4″,5″-hepta- Me-EGCG, 5,7,3′,4′,3″,4″,5″-hepta- Me-EGCG and 5,7,3′,4′,5′,3″,4″,5″-octa- Me-EGCG were identified in the two reaction products, of which, 3 were contained in reaction product TRI-1 and 2 in reaction product TRI-2.

Key words：EGCG；methylation；molecular modification；methyl iodide；chemosynthesis

表沒食子兒茶素沒食子酸(EGCG)有多種保健功能，是茶葉中的核心功能活性成分之一，在醫藥和食品研究領域倍受關注。近年來，隨著研究的不斷深入，發現EGCG經分子修飾后形成的一些衍生物生物利用度明顯提高，并且在某些方面表現出了比EGCG更強的生理活性，例如甲基化兒茶素具有更強的抗過敏活性[1]、乙酰化兒茶素對蛋白酶具有更強的抑制活性[2]、糖苷化兒茶素具有更強的抗褐變活性[3]、以及酯化制備所得到的脂溶性兒茶素在水不溶體系中也能充分發揮其優越的抗氧化性能[4]等。因此，EGCG的分子修飾及其產物已經成為了當前茶葉天然產物研究領域的熱點之一[5-7]。

甲基兒茶素的天然資源十分有限，在茶葉中含量普遍較低，只有極少數的茶樹品種中的甲基兒茶素的含量在1%以上[8-11]；可見，僅靠從茶葉中提取制備不能滿足當前研究和后續產品開發等多方面的需求；如果能夠利用現有的茶葉提取物(茶多酚或兒茶素單體)為原料，通過化學合成等方法制備甲基兒茶素，對于今后進一步研究甲基兒茶素及其天然藥物和功能食品將具有重要的理論意義和實際應用價值。目前，一些類型的甲基兒茶素(如EGCG 4′Me、EGCG 4″Me)的化學合成已有初步報道[12-13]。

本研究從化學合成的角度出發，采用碘甲烷為甲基供體，以EGCG為反應底物，通過控制反應條件合成系列甲基EGCG衍生物，并采用HPLC-MS和NMR對其結構進行鑒定，探索EGCG甲基化分子修飾的反應體系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

EGCG(純度為98%) 杭州禾田生物技術有限公司；碘甲烷、碳酸鉀、丙酮均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純；氘代氯仿、氘代甲醇、氘代二甲基亞砜(DMSO)均為光譜純。

Rotavapor R-124型旋轉蒸發儀 瑞士步琪有限公司；Waters 2690-996(PAD)色譜系統；Agilent 1100液相/Bruker esquire 3000plus 離子阱ESI質譜儀；1H-NMR分析儀(Bruker AM 300 MHz)；13C-NMR分析儀(Bruker AM 100MHz)。

1.2 分析方法

1.2.1 HPLC參數條件

Varian Prostar 1.0高效液相色譜儀；流動相：A為H2O、B為CH3CN；制備柱：Merck C18(25mm×250mm，10μm)；制備時間：180min；組分收集：15mL/管；0～15min，流動相A保持92%，流動相B保持8%；在15～180min，梯度洗脫，流動相A由92%降低至62%，流動相B由8%增加至38%。

1.2.2 HPLC-MS分析條件

分析操作系統：Agilent Chem-workstation/Bruker Daltonic data analysis V3.1；流動相：A 為H2O， B為99.9% CH3CN 和0.1% HCOOH；分析柱：Merck C18(2.0mm×50mm，3μm)；分析時間：15min；流速：0.5mL/min；檢測波長：210nm；柱溫：25℃；在0～9min梯度洗脫，流動相A由100%降低至0，流動相B由0增加至100%；之后等梯度保持至第12min；在12.1min，流動相A為100%，流動相B為0；之后等梯度保持至第15min。

1.2.3 NMR測試系統

1H-NMR測試儀：Bruker AM 300MHz；13C-NMR測試儀：Bruker AM 100MHz；溶劑：氘代試劑。

1.3 方法

本實驗設計了兩個反應體系。按化學反應方程式計算，每8mol的碘甲烷可與1mol的EGCG完全反應，為研究EGCG的8個羥基是否都能被甲基化，反應體系I采用了過量的碘甲烷(10倍)與EGCG進行甲基化反應；為研究EGCG的8個羥基中哪些羥基最易甲基化，反應體系II采用了EGCG與碘甲烷物質的量比為1:1的反應體系。具體如下：

反應體系I：取EGCG 2.3g加入100mL丙酮中，加入2.5g K2CO3做催化劑，在60℃磁力攪拌回流，在回流過程中滴加25mL(EGCG與碘甲烷的物質的量比為1:80)的碘甲烷，反應4h，在60℃旋轉蒸發除掉丙酮，得到淡黃色晶體(TRI-1)2.7g。

反應體系II：取EGCG 4.584g加入100mL丙酮中，加入2.5g K2CO3作催化劑，在60℃磁力攪拌回流，在回流過程中滴加碘甲烷0.623mL(EGCG與碘甲烷的物質的量比為1:1)，反應4h，在60℃旋轉蒸發除掉丙酮，得到淡紅棕色晶體(TRI-2)4.8g。

式中：m1為甲基化EGCG單體質量/g；m0為EGCG質量/g。

2 結果與分析

2.1 TRI-1和TRI-2的化學成分

采用制備HPLC，從反應體系I的產物TRI-1分離純化得到3個化合物；采用HPLC-MS和NMR進行結構分析，分別為TRI-1-1(5,3′,4′,5′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG)、TRI-1-2(5,7,3′,4′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG)和TRI-1-3(5,7,3′,4′,5′,3″,4″,5″-octa- Me-EGCG)；從反應體系II的產物TRI-2分離鑒定出兩個化合物，分別為TRI-2-1(4″-Me-EGCG)和TRI-2-2(4′,4″-di-Me-EGCG)。可見，在反應體系產物中，有單甲基化、雙甲基化、七甲基化以及八甲基化的EGCG衍生物存在；此外，通過分析產物的化學結構發現，EGCG的4″位易被甲基化。EGCG經甲基化分子修飾后得到的5個化合物的化學結構如圖1所示。

圖1 EGCG及其甲基化產物化學結構式Fig.1 Chemical structures of EGCG derivatives

2.2 TRI-1和TRI-2化學成分的HPLC分析及單體制備

圖2 樣品TRI-1及其甲基化衍生物HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of reaction product TRI-1 (from reaction system No.1 in which the molar ratio between EGCG and methyl iodide was 1:80) and 3 constituents in it

圖3 TRI-2及其甲基化衍生物HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of reaction product TRI-2 (from reaction system No.2 in which the molar ratio between EGCG and methyl iodide was 1:80) and 2 constituents in it

由圖2、3可見，在該實驗的分析條件下，化合物能得到有效的分離和制備。經分析計算，TRI-1-1、TRI-1-2、TRI-1-3、TRI-2-1和TRI-2-2的產率分別為0.36%、0.27%、0.49%、0.76%和0.42%。

2.3 結構鑒定

表1 EGCG及其甲基化衍生物碳譜信號歸屬Table 1 Assignment of13C NMR spectral signals of EGCG, 3 constituents in reaction product TRI-1 and 2 constituents in reaction product TRI-2

化合物 TRI-1-1，ESI-MS m/z：557.1[M+H]+、1111.7[2M－H]－；化合物TRI-1-2，ESI-MS m/z：557.2[M+H]+、1135.4[2M+Na]+、555.5[M－H]－；化合物TRI-1-3，ESIMS m/z：571.1[M+H]+、1162.8[2M+Na]+；化合物TRI-2-1，ESI-MS m/z：473.0[M+H]+、967.2[2M+Na]+、943.4[2M－H]－；化合物TRI-2-2，ESI-MS m/z：487.0[M+H]+、995.1[2M+Na]+、971.2[2M －H]－；13CNMR數據見表1，1H NMR數據見表2。

表2 EGCG及其甲基化衍生物氫譜的信號歸屬Table 2 Assignment of1H NMR spectral signals of EGCG, 3 constituents in reaction product TRI-1 and 2 constituents in reaction product TRI-2

3 討 論

本實驗建立了兩個化學反應體系，采用化學合成的方法，進行了EGCG甲基化分子修飾的研究。結果表明，這兩個體系都能有效完成EGCG的甲基化分子修飾；并采用現代色譜純化技術，從反應產物中分離純化出5個EGCG甲基化衍生物，進一步查明了其化學結構。本實驗所設計的七甲基化和八甲基化EGCG化學合成方法目前尚未見報道，且發現了EGCG的4″位易被甲基化，這將十分有助于甲基化兒茶素的進一步開發利用。但該方法采用劇毒的碘甲烷為甲基化試劑，對后續的甲基兒茶素的純化以及藥理方面的利用提出了很高的要求。因此，綠色、高效的甲基化兒茶素的合成途徑以及甲基化兒茶素的生物活性分析等將有待深入研究。

此外，本研究在化學反應體系的構建方面，也進行了初步的優化分析探索：1)在反應介質條件的選擇方面，由于EGCG分子中具有大量的酚羥基，可游離出H+，故顯酸性，若進行酚羥基上氫離子的甲基反應需在堿性條件下形成大量的酚氧負離子，但如果堿性太強(如NaOH)則反應過于劇烈，容易引起副反應，導致產率下降，故本實驗選用碳酸鉀做催化劑，在丙酮溶液中形成弱堿性條件進行反應；2)在反應溫度的選擇方面，實驗發現甲基化反應的溫度控制在60℃較合適，若溫度較低，反應在弱堿性條件下氧化速率大大增加，生成大量的酚氧負離子，酚氧負離子容易進一步失去電子，生成鄰醌，鄰醌則可發生聚合生成紅棕色的聚合物，使EGCG上的羥基無法進行甲基取代；3)在反應時間的選擇方面，實驗發現，在弱堿性條件下，酚羥基甲基化反應在4h左右即可完成，故從成本方面考慮反應時間控制在4h左右。

[1] SANO M, SUZUKI M, MIYASE T, et al. Novel anti-allergic catechin derivatives isolated from oolong tea[J]. J Agric Food Chem, 1999, 47(5): 1906-1910.

[2] LANDIS-PIWOWAR K R, HUO Congde, CHEN Di, et al. A novel prodrug of the green tea polyphenol (-)-Epigallocatechin-3-Gallate as a potential anticancer agent[J]. Cancer Research, 2007, 67(9): 4303-4310.

[3] MOON Y H, LEE J H, AHN J S, et al. Synthesis, structure analyses, and characterization of novel epigallocatechin gallate (EGCG) glycosides using the glucansucrase from Leuconostoc mesenteroides B-1299CB[J].J Agric Food Chem, 2006, 54(4): 1230-1237.

[4] 陳平, 孫東, 鄭小明. EGCG棕櫚酸酯的制備、結構及其抗氧化活性[J]. 浙江大學學報: 理學版, 2003, 30(4): 422-425.

[5] 呂海鵬, 林智, 譚俊峰, 等. 茶葉中EGCG3"Me的研究與開發[J]. 食品工業科技, 2008, 29(12): 275-277.

[6] 孫業良, 呂海鵬, 林智, 等. 茶葉中EGCG3″Me的分析方法研究[J].茶葉科學, 2009, 29(5): 379-384.

[7] 周蓓, 王琳, 李偉, 等. 茶葉中甲基化兒茶素的分離、純化和高效液相色譜法分析[J]. 分析化學, 2008, 36(4): 494-498.

[8] 呂海鵬, 譚俊峰, 林智. 茶樹種質資源EGCG3"Me含量及其變化規律研究[J]. 茶葉科學, 2006, 26(4): 310-314.

[9] 羅正飛, 龔正禮, 汪毅, 等. 茶葉中甲基化EGCG的研究[J]. 西南大學學報: 自然科學版, 2008, 30(3): 56-59.

[10] 呂海鵬, 林智, 譚俊峰, 等. 茶葉中的EGCG3″Me研究[J]. 食品與發酵工業, 2008, 34(10): 22-25.

[11] WANG Dongmei, LU Jiali, MIAO Aiqing, et al. HPLC-DAD-ESI-MS/MS analysis of polyphenols and purine alkaloids in leaves of 22 tea cultivars in China[J]. J Food Compos Anal, 2008, 21: 361-369.

[12] MENG Xiaofeng, SANG Shengmin, ZHU Nanqun, et al. Identification and characterization of methylated and ring-fission metabolites of tea catechins formed in humans, mice, and rats[J]. Chem Res Toxicol,2002, 15(8): 1042-1050.

[13] AIHARA Y, YOSHIDA A, FURUTA T, et al. Regioselective synthesis of methylated epigallocatechin gallate via nitrobenzenesulfonyl(Ns) protecting group[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2009, 19(15): 4171-4174.

Methylation of (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)

TS272

A

1002-6630(2010)15-0139-04

2010-03-26

浙江省自然科學基金項目(Y307498)；現代農業產業技術體系建設專項(nycytx-26)；

國家自然科學基金項目(30972404)

呂海鵬(1980—)，男，助理研究員，碩士，主要從事茶葉化學和茶葉加工研究。E-mail：hplv@163.com

*通信作者：林智(1965—)，男，研究員，博士，主要從事茶葉加工和新產品的開發。E-mail：linz@mail.tricaas.com