表沒食子兒茶素沒食子酸酯的甲基化分子修飾

呂海鵬，孫業(yè)良，林 智*，譚俊峰，郭 麗

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，茶葉加工工程研究中心，浙江 杭州 310008)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯的甲基化分子修飾

呂海鵬，孫業(yè)良，林 智*，譚俊峰，郭 麗

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，茶葉加工工程研究中心，浙江 杭州 310008)

研究表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的甲基化分子修飾。以碘甲烷作為甲基供體，采用化學(xué)合成方法研究EGCG的甲基化分子修飾，并通過HPLC-MS和NMR等對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明：采用化學(xué)合成方法能有效完成EGCG的甲基化分子修飾，并分離鑒定出5個(gè)EGCG甲基化衍生物，分別為4″-Me-EGCG、4′,4″-di-Me-EGCG、5,3′,4′,5′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG、5,7,3′,4′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG、5,7,3′,4′,5′,3″,4″,5″-octa-Me-EGCG。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯；甲基化；分子修飾；碘甲烷；化學(xué)合成

Abstract ：For EGCG methylation via chemosynthesis, methyl iodide was used as methyl donor and two reaction systems (No.1 and No.2) were designed, in which the molar ratios between EGCG and methyl iodide were set at 1:80 and 1:1, respectively.Reaction products TRI-1 and TRI-2 obtained from reaction system No.1 and No.2, respectively were characterized by HPLCMS and NMR. The results showed that the molecular modification of EGCG could be successfully accomplished by the use of chemosynthesis, and five EGCG derivatives, namely 4″-Me-EGCG, 4′,4″-di-Me-EGCG, 5,3′,4′,5′,3″,4″,5″-hepta- Me-EGCG, 5,7,3′,4′,3″,4″,5″-hepta- Me-EGCG and 5,7,3′,4′,5′,3″,4″,5″-octa- Me-EGCG were identified in the two reaction products, of which, 3 were contained in reaction product TRI-1 and 2 in reaction product TRI-2.

Key words：EGCG；methylation；molecular modification；methyl iodide；chemosynthesis

表沒食子兒茶素沒食子酸(EGCG)有多種保健功能，是茶葉中的核心功能活性成分之一，在醫(yī)藥和食品研究領(lǐng)域倍受關(guān)注。近年來，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)EGCG經(jīng)分子修飾后形成的一些衍生物生物利用度明顯提高，并且在某些方面表現(xiàn)出了比EGCG更強(qiáng)的生理活性，例如甲基化兒茶素具有更強(qiáng)的抗過敏活性[1]、乙酰化兒茶素對(duì)蛋白酶具有更強(qiáng)的抑制活性[2]、糖苷化兒茶素具有更強(qiáng)的抗褐變活性[3]、以及酯化制備所得到的脂溶性兒茶素在水不溶體系中也能充分發(fā)揮其優(yōu)越的抗氧化性能[4]等。因此，EGCG的分子修飾及其產(chǎn)物已經(jīng)成為了當(dāng)前茶葉天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一[5-7]。

甲基兒茶素的天然資源十分有限，在茶葉中含量普遍較低，只有極少數(shù)的茶樹品種中的甲基兒茶素的含量在1%以上[8-11]；可見，僅靠從茶葉中提取制備不能滿足當(dāng)前研究和后續(xù)產(chǎn)品開發(fā)等多方面的需求；如果能夠利用現(xiàn)有的茶葉提取物(茶多酚或兒茶素單體)為原料，通過化學(xué)合成等方法制備甲基兒茶素，對(duì)于今后進(jìn)一步研究甲基兒茶素及其天然藥物和功能食品將具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，一些類型的甲基兒茶素(如EGCG 4′Me、EGCG 4″Me)的化學(xué)合成已有初步報(bào)道[12-13]。

本研究從化學(xué)合成的角度出發(fā)，采用碘甲烷為甲基供體，以EGCG為反應(yīng)底物，通過控制反應(yīng)條件合成系列甲基EGCG衍生物，并采用HPLC-MS和NMR對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，探索EGCG甲基化分子修飾的反應(yīng)體系。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

EGCG(純度為98%) 杭州禾田生物技術(shù)有限公司；碘甲烷、碳酸鉀、丙酮均為分析純；乙腈、甲醇均為色譜純；氘代氯仿、氘代甲醇、氘代二甲基亞砜(DMSO)均為光譜純。

Rotavapor R-124型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士步琪有限公司；Waters 2690-996(PAD)色譜系統(tǒng)；Agilent 1100液相/Bruker esquire 3000plus 離子阱ESI質(zhì)譜儀；1H-NMR分析儀(Bruker AM 300 MHz)；13C-NMR分析儀(Bruker AM 100MHz)。

1.2 分析方法

1.2.1 HPLC參數(shù)條件

Varian Prostar 1.0高效液相色譜儀；流動(dòng)相：A為H2O、B為CH3CN；制備柱：Merck C18(25mm×250mm，10μm)；制備時(shí)間：180min；組分收集：15mL/管；0～15min，流動(dòng)相A保持92%，流動(dòng)相B保持8%；在15～180min，梯度洗脫，流動(dòng)相A由92%降低至62%，流動(dòng)相B由8%增加至38%。

1.2.2 HPLC-MS分析條件

分析操作系統(tǒng)：Agilent Chem-workstation/Bruker Daltonic data analysis V3.1；流動(dòng)相：A 為H2O， B為99.9% CH3CN 和0.1% HCOOH；分析柱：Merck C18(2.0mm×50mm，3μm)；分析時(shí)間：15min；流速：0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm；柱溫：25℃；在0～9min梯度洗脫，流動(dòng)相A由100%降低至0，流動(dòng)相B由0增加至100%；之后等梯度保持至第12min；在12.1min，流動(dòng)相A為100%，流動(dòng)相B為0；之后等梯度保持至第15min。

1.2.3 NMR測(cè)試系統(tǒng)

1H-NMR測(cè)試儀：Bruker AM 300MHz；13C-NMR測(cè)試儀：Bruker AM 100MHz；溶劑：氘代試劑。

1.3 方法

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了兩個(gè)反應(yīng)體系。按化學(xué)反應(yīng)方程式計(jì)算，每8mol的碘甲烷可與1mol的EGCG完全反應(yīng)，為研究EGCG的8個(gè)羥基是否都能被甲基化，反應(yīng)體系I采用了過量的碘甲烷(10倍)與EGCG進(jìn)行甲基化反應(yīng)；為研究EGCG的8個(gè)羥基中哪些羥基最易甲基化，反應(yīng)體系II采用了EGCG與碘甲烷物質(zhì)的量比為1:1的反應(yīng)體系。具體如下：

反應(yīng)體系I：取EGCG 2.3g加入100mL丙酮中，加入2.5g K2CO3做催化劑，在60℃磁力攪拌回流，在回流過程中滴加25mL(EGCG與碘甲烷的物質(zhì)的量比為1:80)的碘甲烷，反應(yīng)4h，在60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉丙酮，得到淡黃色晶體(TRI-1)2.7g。

反應(yīng)體系II：取EGCG 4.584g加入100mL丙酮中，加入2.5g K2CO3作催化劑，在60℃磁力攪拌回流，在回流過程中滴加碘甲烷0.623mL(EGCG與碘甲烷的物質(zhì)的量比為1:1)，反應(yīng)4h，在60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除掉丙酮，得到淡紅棕色晶體(TRI-2)4.8g。

式中：m1為甲基化EGCG單體質(zhì)量/g；m0為EGCG質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRI-1和TRI-2的化學(xué)成分

采用制備HPLC，從反應(yīng)體系I的產(chǎn)物TRI-1分離純化得到3個(gè)化合物；采用HPLC-MS和NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，分別為TRI-1-1(5,3′,4′,5′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG)、TRI-1-2(5,7,3′,4′,3″,4″,5″-hepta-Me-EGCG)和TRI-1-3(5,7,3′,4′,5′,3″,4″,5″-octa- Me-EGCG)；從反應(yīng)體系II的產(chǎn)物TRI-2分離鑒定出兩個(gè)化合物，分別為TRI-2-1(4″-Me-EGCG)和TRI-2-2(4′,4″-di-Me-EGCG)。可見，在反應(yīng)體系產(chǎn)物中，有單甲基化、雙甲基化、七甲基化以及八甲基化的EGCG衍生物存在；此外，通過分析產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，EGCG的4″位易被甲基化。EGCG經(jīng)甲基化分子修飾后得到的5個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 EGCG及其甲基化產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of EGCG derivatives

2.2 TRI-1和TRI-2化學(xué)成分的HPLC分析及單體制備

圖2 樣品TRI-1及其甲基化衍生物HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of reaction product TRI-1 (from reaction system No.1 in which the molar ratio between EGCG and methyl iodide was 1:80) and 3 constituents in it

圖3 TRI-2及其甲基化衍生物HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of reaction product TRI-2 (from reaction system No.2 in which the molar ratio between EGCG and methyl iodide was 1:80) and 2 constituents in it

由圖2、3可見，在該實(shí)驗(yàn)的分析條件下，化合物能得到有效的分離和制備。經(jīng)分析計(jì)算，TRI-1-1、TRI-1-2、TRI-1-3、TRI-2-1和TRI-2-2的產(chǎn)率分別為0.36%、0.27%、0.49%、0.76%和0.42%。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 EGCG及其甲基化衍生物碳譜信號(hào)歸屬Table 1 Assignment of13C NMR spectral signals of EGCG, 3 constituents in reaction product TRI-1 and 2 constituents in reaction product TRI-2

化合物 TRI-1-1，ESI-MS m/z：557.1[M+H]+、1111.7[2M－H]－；化合物TRI-1-2，ESI-MS m/z：557.2[M+H]+、1135.4[2M+Na]+、555.5[M－H]－；化合物TRI-1-3，ESIMS m/z：571.1[M+H]+、1162.8[2M+Na]+；化合物TRI-2-1，ESI-MS m/z：473.0[M+H]+、967.2[2M+Na]+、943.4[2M－H]－；化合物TRI-2-2，ESI-MS m/z：487.0[M+H]+、995.1[2M+Na]+、971.2[2M －H]－；13CNMR數(shù)據(jù)見表1，1H NMR數(shù)據(jù)見表2。

表2 EGCG及其甲基化衍生物氫譜的信號(hào)歸屬Table 2 Assignment of1H NMR spectral signals of EGCG, 3 constituents in reaction product TRI-1 and 2 constituents in reaction product TRI-2

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)建立了兩個(gè)化學(xué)反應(yīng)體系，采用化學(xué)合成的方法，進(jìn)行了EGCG甲基化分子修飾的研究。結(jié)果表明，這兩個(gè)體系都能有效完成EGCG的甲基化分子修飾；并采用現(xiàn)代色譜純化技術(shù)，從反應(yīng)產(chǎn)物中分離純化出5個(gè)EGCG甲基化衍生物，進(jìn)一步查明了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的七甲基化和八甲基化EGCG化學(xué)合成方法目前尚未見報(bào)道，且發(fā)現(xiàn)了EGCG的4″位易被甲基化，這將十分有助于甲基化兒茶素的進(jìn)一步開發(fā)利用。但該方法采用劇毒的碘甲烷為甲基化試劑，對(duì)后續(xù)的甲基兒茶素的純化以及藥理方面的利用提出了很高的要求。因此，綠色、高效的甲基化兒茶素的合成途徑以及甲基化兒茶素的生物活性分析等將有待深入研究。

此外，本研究在化學(xué)反應(yīng)體系的構(gòu)建方面，也進(jìn)行了初步的優(yōu)化分析探索：1)在反應(yīng)介質(zhì)條件的選擇方面，由于EGCG分子中具有大量的酚羥基，可游離出H+，故顯酸性，若進(jìn)行酚羥基上氫離子的甲基反應(yīng)需在堿性條件下形成大量的酚氧負(fù)離子，但如果堿性太強(qiáng)(如NaOH)則反應(yīng)過于劇烈，容易引起副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)率下降，故本實(shí)驗(yàn)選用碳酸鉀做催化劑，在丙酮溶液中形成弱堿性條件進(jìn)行反應(yīng)；2)在反應(yīng)溫度的選擇方面，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲基化反應(yīng)的溫度控制在60℃較合適，若溫度較低，反應(yīng)在弱堿性條件下氧化速率大大增加，生成大量的酚氧負(fù)離子，酚氧負(fù)離子容易進(jìn)一步失去電子，生成鄰醌，鄰醌則可發(fā)生聚合生成紅棕色的聚合物，使EGCG上的羥基無法進(jìn)行甲基取代；3)在反應(yīng)時(shí)間的選擇方面，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在弱堿性條件下，酚羥基甲基化反應(yīng)在4h左右即可完成，故從成本方面考慮反應(yīng)時(shí)間控制在4h左右。

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Methylation of (-)-Epigallocatechin-3-gallate (EGCG)

TS272

A

1002-6630(2010)15-0139-04

2010-03-26

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y307498)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(nycytx-26)；

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972404)

呂海鵬(1980—)，男，助理研究員，碩士，主要從事茶葉化學(xué)和茶葉加工研究。E-mail：hplv@163.com

*通信作者：林智(1965—)，男，研究員，博士，主要從事茶葉加工和新產(chǎn)品的開發(fā)。E-mail：linz@mail.tricaas.com