海洋小鏈霉菌DY2741抗菌物質的溶解性質及分離純化

劉 偉，徐 濤，蔡敬民,*，潘仁瑞，吳 纓

(1.安徽農業大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；2.合肥學院生物與環境工程系，安徽 合肥 230022；3.合肥學院化學與材料工程系，安徽 合肥 230022)

海洋小鏈霉菌DY2741抗菌物質的溶解性質及分離純化

劉 偉1,2，徐 濤2，蔡敬民1,2,*，潘仁瑞2，吳 纓3

(1.安徽農業大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；2.合肥學院生物與環境工程系，安徽 合肥 230022；3.合肥學院化學與材料工程系，安徽 合肥 230022)

在拮抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性的指示下將一株海洋小鏈霉菌DY2741的代謝產物分離純化。通過對該菌發酵液中抗菌物質的溶解性質測定，可推知該物質極性中等。Sephadex LH-20柱色譜分離后，經抗菌活性檢測發現兩個活性峰，其中第2個峰的抑菌活性較強。將第2個峰的洗脫液各組分進行薄層色譜分析，選取斑點清晰且單一的組分進行氣相色譜-質譜聯用分析，總離子流圖表明該組分成分單一，根據質譜圖譜與標準譜庫比對以及紅外光譜分析，初步判斷該組分為鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。該成分為小鏈霉菌DY2741的主要抗菌物質之一。

海洋小鏈霉菌；抗菌物質；溶解性質；分離純化

Abstract：One aliquot of the fermentation supernatant of Streptomyces parvus DY2741 using soybean powder as substrate was vacuum dried and the residue was extracted with water or 5 different organic solvent alone. The ethyl acetate extract was found to have good inhibitory activity against both S. aureus and E. coli. Another aliquot of the fermentation supernatant was directly extracted with ethyl acetate 3 times and the extracts were then pooled and condensed in a rotation evaporator and blown to dryness under nitrogen. Finally, the residue was dissolved in methanol and filtrated before purification/fractionization on Sephadex LH-20 column. As a result, two antibacterial fractions were obtained and the second eluting peak presented stronger inhibitory activities against both bacterial species. Thin layer chromatography was used to further fractionize the fraction with higher antibacterial activity. The subfaraction displaying a clear single spot was demonstrated by gas chromatography-mass spectrometry to contain a single composition, which was preliminarily identified to be dibutyl phthalate (DBP) based on searching Wiley Registry of Mass Spectral Data and infrared spectral analysis. Therefore, DBP is one of the major antibacterial substances produced by Streptomyces parvus DY2741.

Key words：marine Streptomyces parvus；antibacterial substance；solubility；separation and purification

海洋巨大的資源庫意味著巨大的財富，因此在20世紀90年代引起各國學者研究熱潮。海洋環境的獨特性和極端性特點，所發現的抗生素往往是新穎的，可能具有很好的應用前景。國內很早就使用海洋生物治療疾病，但從海洋微生物中尋找抗菌物質的研究則起步較晚，黃維真等[1]在福建鼓浪嶼沿海的海泥中分離到一株海洋放線菌——魯特格鏈霉菌鼓浪嶼亞種(Str. rutgersensis subsp. gulangyunensis)，它產生廣譜、低毒性的抗生物質(minobiosamine)和肌醇胺霉素等，對綠膿桿菌和一些耐藥性革蘭氏陰性菌具有較強的抗性。王書錦等[2]在黃、渤海、遼寧近海地區采樣，分離到5608株海洋細菌，測定表明，約有25%的菌株具有不同程度的抗病原真菌、病原細菌的能力。劉全永等[3]從海洋細菌LUB02中分離到廣譜抗真菌活性物質，對人和動物條件病原菌白色念珠菌(Candida albicans)有較強的抑制作用。王瑩等[4]從東海溫州海域采樣，分離到195株海洋細菌，篩選出22株菌具有抗菌活性，并對其中抗菌活性較強的6株進行16S rDNA序列分析。近年來不斷有新發現的海洋微生物菌種及其產生新的抗菌物質的報道[5-6]。

因此，從海洋中篩選產高效、新穎、低毒的抗菌活性物質潛力巨大。本實驗室從廈門附近海域篩選到一株具有廣譜抗菌活性的小鏈霉菌。本實驗在研究其抗菌物質溶解性質的基礎上，采用Sephadex LH-20柱色譜進行分離、純化，使用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)和紅外光譜研究其成分。為進一步研究和確定小鏈霉菌DY2741的代謝產物提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

小鏈霉菌DY2741自廈門大嶼島海域潮間帶海洋軟體動物中分離。抗菌活性檢測指示菌株：革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌(S.aureus)、革蘭氏陰性菌大腸桿菌(E.coli)來源于合肥學院生物與環境工程系菌種保藏中心。

1.2 培養基

菌株DY2741培養用培養基：1)菌株斜面培養保存培養基：高氏合成Ⅰ號培養基[7]；2)菌種種子培養基：葡萄糖酵母粉培養基[7]；3)菌株液體發酵培養基：黃豆粉培養基[8]。鏈霉菌DY2741所用培養基均為人工海水配制，所有培養基均于121℃滅菌20min。指示菌培養基：牛肉膏蛋白胨培養基[7]。

1.3 儀器與設備

QP5050氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；Nicolet 8700傅里葉紅外光譜儀 美國熱電儀器公司；RE-52C旋轉蒸發儀 上海青浦滬西儀器廠；NAS-12氮吹儀 合肥艾本森科學儀器有限公司；SP-752紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.4 菌種DY2741發酵液的制備

將小鏈霉菌DY2741接種于高氏Ⅰ號合成培養基斜面上，28℃培養7d。取新鮮培養的DY2741斜面用10mL無菌水洗下孢子，振蕩，制成菌懸液。將菌懸液按體積分數10%的接種量接種于種子培養基中，于28℃、180r/min培養3d。然后按體積分數5%的接種量接種于發酵培養基中，于28℃、180r/min培養5d。收集發酵液，5000r/min離心15min，丟棄菌體，留上清。

1.5 指示菌平板的制備

將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨培養基斜面上，37℃培養24h。取新鮮培養的指示菌斜面用0.85g/100mL的生理鹽水洗下，并將其稀釋成109個/mL的菌懸液(波長650nm，控制透光率為20%)。取5mL經調整到達合適濃度的指示菌菌懸液，同100mL冷卻至60℃的牛肉膏蛋白胨培養基充分混合，傾注于平皿中。

1.6 抗菌物質在不同溶劑中的溶解性測定

取發酵上清液，每份10mL，經真空冷凍干燥成粉后，分別加入無菌水、甲醇、正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚各1mL萃取過夜，以各個純溶劑為對照。采用管碟法[9]以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌進行萃取液的抑菌活性測定。測量抑菌圈直徑并記錄抑菌結果，所有實驗重復3次。

1.7 不同pH值下不同萃取劑的萃取實驗

取發酵上清液，每份10mL，分別調節發酵液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入等量的乙酸乙酯，充分混勻，靜置萃取過夜。采用管碟法以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌分別檢測有機相和下層水相(pH值調回7.0)的抑菌活性，設純溶劑為對照組。測量抑菌圈直徑并記錄抑菌結果，所有實驗重復3次。

1.8 發酵液的萃取實驗

取發酵液上清，調整pH值至7.0，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液以旋轉蒸發儀濃縮、氮吹儀吹干，加入少量甲醇溶解后用0.22μm的尼龍微孔濾膜過濾備用。

1.9 Sephadex LH-20柱色譜分離

將經萃取處理的濃縮液進行葡聚糖凝膠色譜分離，所用色譜分離介質為Sephadex LH-20(2.6cm×100cm)，以體積分數1%上樣體積進行凝膠層析。1.5L洗脫液，其組成為甲醇與水體積比6:4，流速為1mL/min，每管收集7mL。通過薄層色譜法(TLC)分析，合并相同組分并減壓濃縮，凍干，適量甲醇溶解。采用管碟法以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌檢測洗脫液的抑菌活性，每個牛津杯中加入200μL洗脫液。測量抑菌圈直徑并記錄抑菌結果。

1.10 活性成分分析

薄層色譜分析：薄層板為Merck Silica gel 60 F254，展開劑為石油醚、乙酸乙酯、甲醇其體積比為3:1:0.5，紫外燈254、365nm波長處顯影和茴香醛染色觀察。

GC-MS分析：毛細管色譜柱型號為Rtx-5ms(30m×0.25mm，0.25μm)，柱溫升溫程序：初始升溫150℃，保持4min，以4℃/min升溫至250℃，保持10min[10]；進樣量：5μL，全掃描質量范圍：m/z 40～400。樣品分析前經0.22μm尼龍微孔濾膜過濾。

傅里葉紅外變換光譜分析：將1mg樣品加入到干燥的KBr晶體粉末中，壓片后再轉移至窗片中央直接測定。樣品測定前先用KBr晶體粉末做空白實驗測定，樣品實測的FTIR均需扣去空白峰，以消除空氣中水汽影響。分辨率：4cm-1，掃描次數：32次，增強因子：1.8，半峰寬：20.2cm-1。

1.11 數據處理

2 結果與分析

2.1 抗菌物質的溶解性測定

2.1.1 抗菌物質在不同溶劑中的溶解性質

發酵上清液凍干粉在不同溶劑中溶解后，通過萃取液對細菌的抑菌活性大小反映抗菌物質在不同溶劑中的溶解性質，結果見表1。

表1 抗菌物質在不同溶劑中的溶解情況Table 1 Anti-S. aureus and E. coli activities of different solvent extracts of the freeze-dried residue of the fermentation supernatant of Streptomyces parvus DY2741

從表1可以看出，乙酸乙酯萃取液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑最大，其次是二氯甲烷、正丁醇，其他溶劑抑菌活性相對較低。由此可推知，該抗菌物質可能是一種中等極性的脂溶性物質。抗菌物質在乙酸乙酯中的溶解性最好，也可溶于正丁醇、氯仿和甲醇，微溶于石油醚和水，抗菌物質溶解性質的研究結果為進一步分離純化提供了理論參考。

2.1.2 不同pH值條件下不同萃取物的抑菌效果

為了進一步分離純化小鏈霉菌DY2741的抗菌物質，應研究其極性，因此對發酵液不同pH值條件下抗菌物質的萃取效果進行研究。萃取劑與不同pH值的發酵上清液的體積比為1:1。萃取相(有機相)及水相的抑菌活性見表2。

從表2可以看出，在不同pH值條件下乙酸乙酯的水相均表現為抑菌圈為0mm，無抑菌活性；而有機相的抑菌圈大小與pH值存在相關性。在接近pH值中性條件下有機相的抑菌圈直徑最大。對照組(純溶劑)均無抑菌活性。由此判斷該抗菌物質極性中等。

2.2 Sephadex LH-20柱色譜分離組分的抑菌活性

為了分離純化經乙酸乙酯萃取的粗提物，使用Sephadex LH-20柱色譜進行分離，共收集洗脫液182管。以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌檢測洗脫液的抑菌活性，結果見圖1。

圖1 Sephadex LH-20柱色譜分離后洗脫液的抑菌活性Fig.1 Anti-S. aureus and E. coli activities of each elution fraction of the ethyl acetate (at pH 7) extract of the fermentation supernatant of Streptomyces parvus DY2741 on Sephadex LH-20 column

由圖1可知，洗脫液經檢測出現了兩個抑菌活性峰，B峰對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有明顯的抑菌活性，故選取此峰作進一步研究。

2.3 活性成分分析

對B峰中各組分進行薄層色譜(TLC)分析，其中89～97管樣品Rf=0.25，紫外、熒光顯影和茴香醛染色顯示其斑點單一且清晰，提示該樣品組分單一。

對89～97管樣品進行氣質聯用(GC-MS)分析，總離子流圖(TIC)為單一峰(圖2)；MS圖譜(圖3)與標準譜庫WILEY7(圖4)進行比對，該組分與鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)相似度達87%。

表2 在不同pH值條件下萃取物的抑菌活性Table 2 Anti-S. aureus and E. coli activities of lower and upper phases resulting from extraction of the fermentation supernatant of Streptomyces parvus DY2741 with ethyl acetate under varying pH conditions

89～97管樣品的紅外光譜分析如下：1706cm-1對應于C＝O的伸縮振動，1289cm-1和1136cm-1對應于C—O的伸縮振動，推測該化合物結構中有酯鍵。3067cm-1對應于芳環上C—H的伸縮振動，1600cm-1處的組合峰對應于芳環上C—C的的伸縮振動，推測該化合物結構中有苯環。2958cm-1對應于甲基(—CH3)的C—H伸縮振動，2930cm-1和2856cm-1對應于亞甲基(—CH2—)的C—H伸縮振動，1456cm-1對應于甲基(—CH3)不對稱變形振動或是亞甲基(—CH2—)對稱變形振動。綜上所述，該物質紅外光譜具有明顯的芳香酯類特征。

圖2 89～97管樣品總離子流圖(TIC)Fig.2 Total ion chromatogram (TIC) of pooled fractions 89 through 97

圖4 標準譜庫中鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)質譜圖Fig.4 Standard mass spectrum of DBP

El-Naggar[11]報道了鏈霉菌Streptomyces nasri submutant H35產生的鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)具有抗菌活性。不久，Lee[12]報道鏈霉菌Str. melanosporofaciens也產DBP，證明它是葡萄糖苷酶的抑制劑。Roy等[10]研究表明鏈霉菌Str. albidoflavus產生的DBP對G+細菌G－細菌及單細胞的和絲狀真菌都有較強的活性；動物實驗未觀察到急性毒性。Foster等[13]報道DBP對SD大鼠的最小可見損害作用水平為66mg/(kg bw·d)。Mylchreest等[14]報道大劑量給藥(650mg/(kg bw·d))會導致繁殖力下降，減少精子數量和精子畸形。Watanuki等[15]報道DBP對吞噬細胞功能有調節作用。因此，DBP的藥理及毒理作用有待進一步研究。目前，未發現有小鏈霉菌產生DBP的報道。因此，其生物合成和藥物作用機理等方面值得進一步研究。

3 結 論

本實驗室自廈門海域采集的海洋軟體動物中分離得到一株小鏈霉菌DY2741，其發酵產物具有較強的抗菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等致病菌均有較好的抑菌效果。通過對其溶解性質分析初步確定菌株DY2741的抗菌產物為中等極性抗菌物質。Sephadex LH-20柱色譜將其分離，通過金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌檢測洗脫液的抑菌活性，出現兩個活性峰。其中B峰對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有較好的抑菌效果。通過對B峰的洗脫液各組分進行薄層色譜分析，選取斑點清晰且單一的89～97管樣品進行氣相色譜-質譜聯用分析，總離子流圖表明該組分成分單一；根據質譜圖譜與標準譜庫WILEY7對比及FTIR光譜分析，初步判斷該組分為鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)。

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Isolation, Purification and Solubility of Antibacterial Substances from Fermentation Supernatant of Marine Streptomyces parvus DY2741

LIU Wei1,2，XU Tao2，CAI Jing-min1,2,*，PAN Ren-rui2，WU Ying3
(1. School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China；2. Department of Biological and Environmental Engineering, Hefei University, Hefei 230022, China；3. Department of Chemical and Materials Engineering, Hefei University, Hefei 230022, China)

R282.77

A

1002-6630(2010)15-0177-04

2010-04-07

安徽省優秀青年科技基金項目(04043051)；國家自然科學基金項目(30270321)；

合肥學院(引進)人才科研啟動基金計劃項目(08RC12)；安徽省教育廳自然科學研究項目(KJ2008B229)

劉偉(1982—)，男，碩士研究生，主要從事海洋微生物天然產物研究。E-mail：bbliuwei@foxmail.com

*通信作者：蔡敬民(1963—)，男，教授，博士，主要從事微生物酶學和海洋微生物活性產物研究。E-mail：caijingmin@hfuu.edu.cn