Nisin-rbLF-N融合基因的構建及其在大腸桿菌中的表達

袁曉宇，許文濤，黃昆侖，羅云波，谷新晰，田洪濤,,*

(1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

Nisin-rbLF-N融合基因的構建及其在大腸桿菌中的表達

袁曉宇1，許文濤2，黃昆侖2，羅云波2，谷新晰1，田洪濤1,2,*

(1.河北農業大學食品科技學院，河北 保定 071001；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

針對乳鏈菌肽(nisin)抑菌譜窄的缺點，選擇對抗菌譜較廣且具有較強抗性的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，構建融合基因Nisin-rbLF-N。將融合基因克隆到原核表達載體pGEX-4T1中，轉化E. coli BL21(DE3)進行誘導表達，將誘導表達的產物進行Tricine-SDS-PAGE蛋白電泳及抑菌活性檢測。結果表明，克隆菌經誘導后可表達出可觀的融合蛋白，融合蛋白以包涵體形式存在，包涵體經洗滌、尿素溶解、復性后具有抗菌生物活性。

融合基因；誘導表達；抑菌活性

Abstract ：Considering that Nisin has a narrow antibacterial spectrum, rbLF-N with strong inhibitory activity against a wide range of bacteria was used to construct fusion gene Nisin-rbLF-N. The fusion gene was cloned into the expression vector pGEX-4T1, followed by transformation into the E. coli BL21 prokaryotic expression system for protein expression under IPTG induction.The expressed protein encoded by Nisin- rbLF-N gene was detected by Tricine-SDS-PAGE protein electrophoresis and it inhibitory activities against Gram positive and negative bacteria were also assayed. A considerable amount of fusion protein was expressed in E. coli BL21 cells and the protein was mainly found in inclusion bodies. The product obtained from the inclusion bodies subjected to washing, dissolution in 8 mol/L urea and protein refolding had good inhibitory activity against Gram positive bacteria rather than their negative counterparts.

Key words：fusion gene；inducible expression；antibacterial activity

乳鏈菌肽(nisin)又稱乳酸鏈球菌素、尼生素等，它是由乳酸乳球菌某些菌株生長過程中產生的次級代謝產物。對食品傳播的病原菌和腐敗微生物有強的抑制作用[1]。食用后的Nisin在人體的生理pH值條件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會改變人體腸道內正常菌群以及產生如其他抗菌素所出現的抗性問題，更不會與其他抗菌素出現交叉抗性，是一種高效、無毒、安全、性能卓越的天然食品防腐劑[2-3]。Nisin應用前景廣闊，但存在局限性，它只具有G+菌抗性，而不能抑制食品中許多G－致病菌[4-5]，因此擴大Nisin抗菌譜的研究不僅具有理論價值，而且具有十分重要的應用價值。

乳鐵蛋白肽(LFcin)是乳鐵蛋白在酸性環境下經胃蛋白酶作用N端釋放的一段多肽，廣泛存在于動物的多種組織中[6-7]。具有抗菌、抗病毒、抗癌、調節機體免疫等多種生物功能，在眾多的功能中，抗菌功能是最引人注目的。乳鐵蛋白活性多肽具有廣譜抗菌性，對G+菌、G－菌、酵母菌、真菌等均有抗性，其中牛乳鐵蛋白N端多肽(rbLF-N)的抗菌活性較其他的乳鐵蛋白肽活性高，具有很好的應用前景[8-10]。

本研究針對Nisin抑菌譜窄的缺點及對rbLF-N的眾多優點的考慮，選擇對抗菌譜較廣且具有較強抗性的rbLF-N為材料，構建Nisin-rbLF-N融合基因，并在原核表達系統中表達，嘗試獲得具有更強G+菌抗性和G－菌抗性的融合蛋白，以期為進一步構建性能優良的融合抗菌蛋白提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮牛肉購自北京市牛街清真市場。

1.2 表達載體與菌株

pGEM-T easy質粒 大連TaKaRa生物工程有限公司；pGEX-4T1表達質粒 中國農業大學食品與營養工程生物技術實驗室；大腸桿菌E. coli DH5α、BL21(DE3)感受態 北京欣經科生物技術有限公司；干酪乳桿菌、大腸桿菌E. coli 本實驗室保存。

1.3 工具酶與試劑

BamHⅠ和 EcoRⅠ酶制劑 NEB(北京)公司；T4連接酶 Promage公司；DNA Marker DL2000和DNA回收試劑盒 北京Tiangen生化科技有限公司；Tris-base、EDTA、X-Gal、IPTG、氨芐青霉素 Sigma公司；其他試劑均為國產分析純；引物由TaKaRa生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 儀器與設備

20G高速臺式冷凍離心機、20G高速臺式冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；LRH-150B型生化培養箱 廣東省醫療器械廠；DYY-III31A/31B型電泳槽、DYY-III2型穩壓穩流電泳儀 北京六一儀器廠；THZ-C型空氣浴恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；SX-300型凝膠成像系統 上海小源科技有限公司；REVCO超低溫冰箱(－80℃) 美國來亨公司。

1.5 方法

1.5.1 Nisin基因優化及引物合成

根據Genebank公布的Nisin基因序列及蛋白序列，為使目的基因獲得穩定表達，用適于在BL21中表達的密碼子代替那些不適合于在其中表達的密碼子優化Nisin基因[11]，并在5＇端和3＇端設計EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點。優化后的Nisin基因序列由寶生物合成克隆于pMD19-T載體。根據目的序列分別設計引物，上游引物F1：5＇-CGGGATCC ATGAGCACCAAAGAT-3＇；下游引物R1：5＇-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3＇。由上海生工生物工程有限公司合成。在上游引物設計酶切位點EcoRⅠ(下劃線標記)和保護堿基。

1.5.2 提取牛肉總DNA、引物合成

從牛肉中提取總DNA的方法參照文獻[12]，根據GenBank (Original accession number：NM180998) 已知的牛乳鐵蛋白cDNA序列設計引物，上游引物F2：5＇-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3＇；下游引物R2：5＇-CGGAATTC TTACCGGATAC ATGCCAAGGC-3＇，由上海生工生物工程有限公司合成。在上游引物設計與Nisin互補配對的序列(下劃線標記)，下游引物設計酶切位點BamHⅠ(下劃線標記)、終止密碼子和保護堿基。

1.5.3 重組質粒pGEM-T easy/Nisin- rbLF-N的構建與鑒定

以合成的pMD19-T/Nisin質粒為模板，用引物F1、R1進行PCR擴增Nisin基因為179bp，PCR產物純化回收；以提取牛肉總DNA為模板，用引物F2、R2進行PCR擴增rbLF-N基因為181bp，PCR產物純化回收；以純化回收后的Nisin基因和rbLF-N基因為模板，用引物F1、R2進行PCR擴增，Nisin-rbLF-N融合基因約為336bp，PCR產物純化回收后與pGEM-T easy載體連接，并轉化E. coli DH5α，用PCR及EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定陽性克隆。PCR參數為：95℃、4min，94℃、30s；退火溫度58℃、60s，延伸72℃、30s，35個循環、72℃保溫10min。

1.5.4 重組表達質粒pGEX-4T1/Nisin-rbLF-N和基因工程菌的構建

用EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切pGEM-T easy/NisinrbLF-N質粒，瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收NisinrbLF-N片段，并將其連接到以同樣酶切割的載體pGEX-4T1上，構建表達載體，重組質粒進行酶切鑒定。將重組表達質粒pGEX-4T1/Nisin-rbLF-N轉化E. coli BL21(DE3)，構建基因工程菌株。插入pGEX-4T1中的Nisin-rbLF-N基因序列分析由上海生工生物工程有限公司完成。

1.5.5 Nisin-rbLF-N融合基因的誘導表達[13-15]

挑取含有重組質粒的BL21(DE3)白色菌落接種于LB液體培養基中37℃過夜培養，按體積分數5%接種于LB液體培養中于37℃擴大培養直至菌液OD600nm值達0.6～0.8時；加入IPTG使其終濃度為1mmol/L，繼續培養4h；將菌液離心(5000×g，離心10min)收集菌體與pH7.3的0.01mol/L PBS緩沖液中超聲破碎7s，間隔10s，共15次。于4℃、2000×g離心15min，棄去沉淀(基本為菌體和碎片)，上清液于12000×g離心30min，收集沉淀(包涵體)。

1.5.6 表達產物的復性及抗菌活性的初步檢測

將收集的包涵體用8mol/L尿素溶解，采用濃度梯度透析復性[16]。復性透析溶液Ⅰ至Ⅵ分別是6、4、2、1、0.5、0mol/L尿素與20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl溶液配制的pH8.0溶液，每一溶液透析復性8h，復性后溶液于5000×g離心20min收集上清。測試菌株為本實驗室保存的干酪乳桿菌和大腸桿菌，采用瓊脂擴散法檢測抗菌活性。

2 結果與分析

2.1 目的基因的獲得和重組質粒雙酶切鑒定

以合成的pMD19-T/Nisin質粒為模板，用引物F1、R1進行PCR擴增Nisin基因片段，以提取牛肉總DNA為模板，用引物F2、R2進行PCR擴增rbLF-N基因片段(圖1)。以純化回收后的Nisin基因片段和rbLF-N基因片段為模板，用引物F1、R2進行PCR擴增Nisin-rbLF-N融合基因片段(圖2)。由圖1可以看出，在靠近250bp附近有兩條亮帶，大小與欲擴增的目的基因片段相符(Nisin基因為179bp，rbLF-N基因為181bp)。由圖2可以看出，在靠近500bp附近有一條亮帶，測序結果證明與欲擴增的目的基因片段(336bp)的序列相吻合，其編碼的氨基酸閱讀框不變。

圖1 目的基因PCR產物Fig.1 Agarose gel electrophoretic patterns of PCR products of the target gene

圖2 重組質粒酶切結果Fig.2 Agarose gel electrophoretic patterns of PCR products of recombinant plasmid pGEX-4T containing Nisin-rbLF-N gene digested by EcoRⅠand BamHⅠtogether

2.2 重組融合蛋白的表達

Nisin-rbLF-N基因全長336bp，加上谷胱甘肽S-轉移酶(GST)編碼區，重組蛋白由333個氨基酸構成。工程菌經IPTG誘導后，Nisin-rbLF-N基因得到了高效表達，菌體總蛋白中出現了分子質量約為38kD的重組融合蛋白(圖3)，并且融合蛋白的表達量占到菌體蛋白總量的25.3%，產率為1.63g/L。菌體經超聲破碎、離心、Tricine-SDS-PAGE分析[17]發現，Nisin-rbLF-N-GST重組融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

圖3 GST-Nisin- rbLF-N融合蛋白在大腸桿菌中的表達Fig.3 SDS-PAGE patterns showing the heterologous expression of GST-Nisin- rbLF-N fusion protein in E. coli BL21 (DE3)

2.3 重組蛋白的復性及抗菌活性的初步檢測

將離心得到的包涵體用8mol/L尿素溶解，最終質量濃度為0.2g/L，采用濃度梯度透析復性。由圖3可以看出，復性后的上清液中含有目的蛋白(箭頭表示)，但復性率僅為13.32%，融合蛋白含量為0.027g/L。取復性后上清液，采用瓊脂擴散法檢測抗菌活性，測試菌株為本實驗室保存的干酪乳桿菌(G+菌)和大腸桿菌(G－菌)，抗菌活性見圖4、5。抑菌活性檢測表明，Nisin-rbLF-NGST融合蛋白具有革蘭氏陽性菌抗性，但沒有革蘭氏陰性菌抗性。

圖4 融合蛋白對G+菌的抑菌活性Fig.4 Inhibitory effect of GST-Nisin-rbLF-N fusion protein on Gram positive bacteria

圖5 融合蛋白對G－菌的抑菌活性Fig.5 Noninhibitory effect of GST-Nisin-rbLF-N fusion protein on Gram negative bacteria

3 討 論

Nisin是目前國際上最為看好和應用效果最好的微生物型天然食品防腐劑，但也存在局限性，如不能夠抑制G－、酵母菌以及霉菌，在中性及堿性環境中溶解度低、不穩定而且抗菌效果大大降低等[2-3]，而且由于Nisin復雜的翻譯后加工及其獨特的分子結構，單純對其基因進行改造以擴大其抗菌譜及提高其活性難度較大。因此嘗試通過構建融合基因來擴大Nisin的抗菌譜，得到同時抗G－菌和G+菌的融合蛋白，并將其在原核表達系統中進行表達，以期獲得廣譜的重組蛋白生產菌株。

rbLF-N具有廣譜抗菌性，對G+菌、G－菌、酵母菌、真菌等均有抗性，并且因為rbLF-N來源于動物本身，具有傳統抗生素沒有的作用效果，而且它不會使細菌產生抗藥性，也不會殘留于產品中，加之其物化性質和生物學活性獨特，是一種健康安全的產品[6-8]。

本研究將Nisin基因與rbLF-N基因相連，考慮到Nisin復雜的成熟過程，在設計融合基因時，將Nisin設計在融合基因的N端，得到融合基因Nisin-rbLF-N，連接到克隆載體上，經過雙酶切目的片段連接到表達載體pGEX-4T1上轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中表達。選用的pEGX-4T1質粒是表達GST融合蛋白的大腸桿菌高效表達載體，選擇該載體的主要原因是：1)含有非常強的tac啟動子，IPTG可誘導目的基因的高效表達；2)表達產物利于分離純化：融合蛋白可通過谷胱甘肽S-轉移酶(GST)親和層析純化，溫和的抽提條件對融合蛋白的抗原性和功能活性影響極小，再用凝血酶或Xa因子將GST切除，可方便地獲得目的蛋白[8]。

大腸桿菌是目前最常用的外源蛋白表達菌株，容易培養、生長迅速、周期短，成本低，以及有大量可供選擇的克隆載體與表達載體，成為人們克隆表達外源基因的主要菌株。但表達的蛋白多以包涵體形式存在，包涵體是具有膜結構的非結晶性蛋白質聚集體，無生物活性。因此需要用變性劑對包涵體進行處理，在適當的條件下使它經過變性/復性才能具有天然結構和活性。本研究采用濃度梯度透析法對融合蛋白包涵體進行了體外復性，經復性后的融合蛋白進行抗菌活性測定，結果表明Nisin- rbLF-N-GST融合蛋白只具有革蘭氏陽性菌抗性，但沒有革蘭氏陰性菌抗性，分析產生這樣的原因可能有：一是復性率低，僅為13.32%，目的融合蛋白含量減少到0.027g/L，這對抑菌的效果產生了很大影響，因此有必要對Nisin-rbLF-N-GST融合蛋白復性條件(蛋白的初始質量濃度、pH值、溫度、尿素濃度)的優化做進一步研究，減少目的融合蛋白的損失，同時嘗試將融合基因Nisin-rbLF-N轉入畢赤酵母中進行可溶性表達；二是復性可能造成目的融合蛋白的功能損失，要對如何減少或避免因復性造成功能損失做進一步研究，如在復性溶液中加入低分子質量的還原和氧化的含硫基化合物，提供合適的氧化還原電位，幫助二硫鍵的正確形成。

[1] 張百剛, 高華. Nisin抑菌作用的研究[J]. 中國乳品工業, 2008, 36(10): 26-30.

[2] DELVES-BROUGHTON J. Nisin as a food preservative[J]. Food Australia, 2005, 57(12): 525-527.

[3] 王立國. 乳酸鏈球菌素(nisin)在食品中的應用[J]. 食品研究與開發,2008, 29(10): 177-180.

[4] de RUYTER P G, KUIPERS O P, BEERTHUVZEN M M, et al.Functional analysis of promoters in the nisin gene cluster of Lactococcus lactis[J]. Journal of Bacterilogy, 1996, 178(12): 3434-3439.

[5] GUIOTO A, POZZOBON M, CANEVARI M, et al. PEGylation of the antimicrobial peptide nisin A: problems and perspectives[J]. Farmaco,2003, 58(1): 45-50.

[6] LUO Hongxia, CHEN Shangwu, REN Fazheng, et a1. In vitro reconstitution of anti-bacterial pathogen activity by expressed recombinant bovine lactoferrin N-terminal peptide in Escherichia coli[J]. Journal Dairy Research, 2007, 74(2): 1-6.

[7] BELLAMY W, TAKASE M, WAKABAYASHI H, et al. Antibacterial spectrum of lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-termrinal egion of bovine lactoferrin[J]. Journal of Applied Bacteriology,1992, 73(6): 472-479.

[8] 羅紅霞. 牛乳鐵蛋白N末端多肽基因的克隆、表達及抗菌活性的研究[D]. 北京: 中國農業大學, 2006.

[9] 高樹新, 韓玉國, 蘇道, 等. 乳鐵蛋白及其生理機能的研究進展[J].中國牛業科學, 2008, 34(2): 44-47.

[10] FARNAUD S, EVANS R W. Lactoferrin: a multifunctional protein with antimicrobial properties[J]. Molecular Immunology, 2003, 40: 395-405.

[11] 秦偉, 黃昆侖, 羅云波, 等. 水稻密碼子優化的cry2A冰基因在大腸桿菌中的表達及其表達產物的純化[J]. 食品科學, 2008, 29(7): 267-271.

[12] 羅紅霞, 郭慧媛, 林少華, 等. 魯西黃牛乳鐵蛋白N-末端多肽基因的表達與活性檢測[J]. 中國乳品工業, 2005, 33(12): 4-7.

[13] SALUTA M, BELL P A. Troubleshooting GST fusion protein expression in E. coli[J]. Life Science News, 1998, 1: 1-3.

[14] ERGIN A, BüSSOW K, SIEPER J, et al. Homologous high-throughput expression and purification of highly conserved E. coli proteins[J].Microb Cell Fact, 2007, 6(1): 18.

[15] 許文濤, 黃昆侖, 羅云波. bar基因在大腸桿菌中的高效表達及其表達產物的分離和純化[J]. 農業生物技術學報, 2004, 12(5): 583-588.

[16] 楊曉儀, 林鍵, 吳文言. 重組蛋白包涵體的復性研究[J]. 生命科學研究, 2004, 8(2): 100-105.

[17] 郭堯君. 蛋白質電泳實驗技術[M]. 北京: 科學出版社, 1999.

Construction of Nisin-rbLF-N Fusion Gene and Its Expression in Escherichia coli

YUAN Xiao-yu1，XU Wen-tao2，HUANG Kun-lun2，LUO Yun-bo2，GU Xin-xi1，TIAN Hong-tao1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Q786

A

1002-6630(2010)15-0194-04

2009-10-05

國家“863”計劃項目(2006AA10Z440)；農業部“948”項目(2007-Z8)

袁曉宇(1982—)，女，碩士，研究方向為益生菌的開發利用。E-mail：yuanxiaoyu168521@yahoo.com.cn

*通信作者：田洪濤(1963—)，男，教授，博士，研究方向為發酵工程。E-mail：cauxwt@yahoo.cn