重組花生過敏原Ara h 2的生物合成

胡純秋，高金燕，羅春萍，陳紅兵,*，朱 盼

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330047)

重組花生過敏原Ara h 2的生物合成

胡純秋1,2，高金燕1,3，羅春萍1,2，陳紅兵1,2,*，朱 盼1,2

(1.南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學 中德聯合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學生命科學與食品工程學院，江西 南昌 330047)

為獲得重組花生過敏原Ara h 2。通過RT-PCR合成cDNA，并以此為模板進行PCR擴增目的基因Ara h 2，擴增產物經純化后克隆至pMD19-T Simple載體中，構建重組質粒pMD19-T-Ara h 2。上述重組質粒經酶切純化后定向克隆到pGEX-4T-1表達載體中，構建原核表達載體pGEX-4T-1-Ara h 2，并轉化表達宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL中，經IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳結果表明，該表達蛋白大小約為46kD，與理論值相符。通過Glutathione Sepharose 4B凝膠親和層析方法純化融合蛋白GST-Ara h 2，獲得融合蛋白純度約為90%。Western blotting分析表明，經純化的融合蛋白能與抗Ara h 2兔血清發生特異性反應，說明該蛋白具有良好的免疫原性。

食物過敏；花生過敏原Ara h 2；生物合成

Abstract ：Ara h 2 is one of paramount allergens in peanut. The goal of the present study was to biosynthesize recombinant peanut allergen Ara h 2. Peanut cDNA was synthesized from total RNA using Oligo primers by RT-PCR in order to provide a template for the PCR amplification of Ara h 2 gene. The purified amplification products were cloned into the pMD19-T simple vector to construct a recombinant vector carrying Ara h 2 gene, named pMD19-T-Ara h 2. The recombinant plasmid was digested by Nco I and Hind III. The purified digestion products were then ligated to the pGEX-4T-1 expression vector and transformed into the BL21-codonPlus(DE3)-RIPL for 24 h expression under IPTG induction. The target product, GST-Ara h 2 fusion protein, was purified with Glutathione Sepharose 4B. The results of SDS-PAGE and western-blotting showed that GST-Ara h 2 fusion protein was 46 kD in size, with 90% purity and could specifically react with anti-Ara h 2 sera from rabbits, indicating that the recombinant protein has high specificity of immune reaction.

Key words：food allergy；peanut allergen Ara h 2；biosynthesis

花生是一種重要的食物過敏原，屬于世界糧農組織(FAO)報告的八大過敏食物之一[1]。目前已發現11種花生過敏蛋白，其中，Ara h 1和Ara h 2被認為是主要的花生過敏原，90%的花生過敏患者對其過敏[2-3]。Ara h 2是分子質量為17～20kD同種異型蛋白[4]，約占花生蛋白總量的10%[5]，是花生中致敏性最強的組分之一[6]。成功地制備花生過敏原Ara h 2，尤其是重組蛋白的生物合成，可為Ara h 2進一步相關研究提供標準化的實驗材料。同時對開發食品中花生過敏原Ara h 2檢測試劑等也具有重要的經濟價值。為此，本實驗擬以花生過敏原Ara h 2為對象，通過RT-PCR技術，克隆該基因并在原核系統中進行表達，利用Glutathione Sepharose 4B凝膠親和層析純化融合蛋白，探索制備花生過敏原Ara h 2的生物合成方法。

1 材料與方法

1.1 材料

花生產自江西省，為湘花花生品種，購自江西省南昌市青山湖市場。

1.2 兔抗Ara h 2血清的采集

本血清為實驗室自制并保存。主要方法是從花生種子中分離純化Ara h 2，并按常規方法免疫新西蘭大白兔，達到一定效價后采血，分離血清，－80℃保存。

1.3 質粒和菌株

pMD19-T Simple載體 TaKaRa工程有限公司；pGEX-4T-1載體、大腸桿菌E.coli DH5α 本實驗室保存；BL21-codonPlus(DE3)-RIPL Stratagene公司。

1.4 工具酶和試劑

RT-PCR cDNA第一鏈合成試劑盒、Cocktail片劑Roche公司；限制性核酸內切酶EcoRⅠ和NotⅠ、Taq DNA聚合酶 TaKaRa工程有限公司；T4連接酶Promage公司；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒 天根公司；硝酸纖維素膜 Millipore公司；DNA Ladder Marker 北京全式金公司；低分子質量蛋白標準Marker Fermentas公司；Glutathione Sepharose 4B Amersham公司；羊抗兔IgG酶標二抗、4-氯-1-萘酚 Sigma公司；氨芐、IPTG、X-gal 上海生物工程有限公司。

1.5 引物設計與合成

根據GenBank已報道花生過敏原Ara h 2基因序列(登錄號AY158467)，設計了1對引物(下劃線對應部分為酶切位點)：P1(上游)：5′-CGGAATTCATGGCCAA GCTCACCATACTAGTA-3′(EcoR Ⅰ)；P2(下游)：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTATCTGTCTCTGCC-3′(NotⅠ)。

1.6 儀器與設備

迷你型蛋白電泳儀、凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；PCR梯度擴增儀 德國Biometra公司；ALLEGRA-64R高速冷凍離心機 美國Backman公司；超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物技術公司。

1.7 方法

1.7.1 總RNA的提取

具體方法見文獻[7]。

1.7.2 RT-PCR擴增Ara h 2基因

以總RNA為模板，Oligo(dT)為引物，反轉錄合成cDNA。反應體系：10×Reaction Buffer 2.0μL、MgCl2(25mmol/L)4.0μL、dNTP(10mmol/L)2.0μL、Oligo(dT)(0.8μg/μL)引物 2.0μL、RNase Inhibitor (50U/μL)1.0μL、AMV逆轉錄酶(≥2.5U/μL) 0.8μL、無RNase水5.2μL、總RNA樣品3.0μL。反應條件為：25℃溫浴10min，42℃反應1h，合成cDNA，然后99℃變性5min，最后4℃放置5min。再以此反轉錄產物為模板，P1、P2為特異性引物，進行擴增，反應體系：10×Reaction Buffer 10.0μL、dNTP(2.5mmol/L)8.0μL、引物P1/P2(60pmol/L)10.0μL、Taq酶(5U/μL)1.0μL、雙蒸水59.0μL、cDNA 2.0μL。反應條件為：94℃預變性30s；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環；循環結束后72℃再延伸10min。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7.3 Ara h 2基因的克隆及篩選

采用DNA回收試劑盒純化PCR產物，操作步驟按說明書進行。將純化的PCR產物經瓊脂糖電泳鑒定純度后，與pMD19-T Simple載體連接，16℃反應1h，并轉化入E.coli DH5α感受態細胞，構建的重組質粒pMD19-T-Ara h 2，鋪平板，過夜培養，篩選陽性克隆子，提取質粒。重組質粒采用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定。重組質粒及酶切產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7.4 Ara h 2基因的測序、序列分析

將鑒定的陽性克隆質粒送上海生物公司進行雙向測序，通過Blast比對進行同源性分析。

1.7.5 原核表達重組質粒的構建

將經測序正確的重組質粒及表達載體pGEX-4T-1，均用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，同時回收小片段及酶切后的載體。用T4連接酶連接兩個回收片段，轉化E. coli DH 5α感受態細胞后，涂布于含氨芐的平板，挑菌擴大培養，提取質粒，篩選陽性重組質粒pGEX-4T-1-Ara h 2，并通過EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定。重組質粒及酶切產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.7.6 Ara h 2基因的誘導表達及檢測

將經鑒定為陽性的重組質粒，轉化到表達宿主菌BL21-codonPlus(DE3)-RIPL中，涂布于含氨芐的平板，37℃過夜培養。挑單菌落接種于2mL含氨芐的LB培養基，37℃振蕩培養過夜。次日吸取1mL的過夜培養菌液接種于50mL新鮮培養基中，37℃振蕩培養至OD600nm值為0.6～0.7，加IPTG至終濃度為1.0mmol/L，誘導表達，并設IPTG未誘導為對照。離心分別收集培養2、4、6、8h的菌體，經PBS緩沖液洗滌兩次后，再用PBS緩沖液溶解、等體積的2×SDS懸浮，100℃水浴5min，SDS -PAGE電泳分析。

1.7.7 融合蛋白的純化

將含有pGEX-4T-1-Ara h 2的重組質粒的菌液，誘導表達2h后，收集菌液。離心、洗滌沉淀。用PBS緩沖液溶解菌體，加入蛋白酶抑制劑Cocktail片劑，混勻。用超聲波破碎細胞，超聲條件為：功率300W，超聲3s、間隔3s，共60次。樣品經超聲后4℃、10000r/min離心15min。取出上清液轉移至新離心管中，在相同條件下再次離心30min，取上清。將所得上清采用Glutathione Sepharose 4B凝膠親和層析純化，方法按Amersham公司操作手冊進行。并取純化產物5μL，加等體積的2×SDS懸浮，100℃水浴5min，SDS-PAGE電泳分析。

1.7.8 融合蛋白的免疫印跡

將純化產物經SDS-PAGE電泳后，轉移電轉至PVDF膜上，條件為：恒流40mA，1h；然后將膜取出，用5%的脫脂乳封阻，37℃溫育1h；用TBST洗滌3次，每次洗滌10min，加入1:3000稀釋的兔抗Ara h 2血清將膜浸沒，37℃溫育1h；洗滌(方法如前述)；加入1:5000稀釋的HRP酶標羊抗兔IgG二抗，37℃溫育1h；洗滌(方法如前述)；最后加入4-氯-1-萘酚顯色5min即可。

2 結果與分析

2.1 Ara h 2 cDNA片段的擴增

圖1 RT-PCR產物電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoretic pattern of the RT-PCR products of peanut Ara h 2 cDNA fragment

以總RNA為基因來源，通過RT-PCR擴增Ara h 2 cDNA片段，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖1所示，在約500bp處有特異性條帶，其大小與預計的Ara h 2相符合，可以初步確定為Ara h 2 cDNA片段。

2.2 重組質粒的酶切鑒定

圖2 重組質粒的酶切鑒定Fig.2 Agarose gel electrophoretic patterns of pMD19-T-Ara h 2 before and after digestion with EcoR I and Not I

將重組質粒pMD19-T-Ara h 2分別經EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果如圖2所示。酶切所得的小片段約為500bp，與目的基因片段大小相符，另一片段為載體大小，初步證明重組質粒構建成功。

2.3 Ara h 2基因的測序及序列分析

將測序結果用Blast工具分析其同源性，結果表明，克隆的基因序列與已經公布的Ara h 2.02基因序列同源性達到100%。由此可證明已經成功克隆到正確的Ara h 2.02基因序列。

2.4 重組表達質粒的雙酶切鑒定

圖3 pGEX-4T-1-Ara h 2的雙酶切鑒定結果Fig.3 Agarose gel electrophoretic patterns of pGEX-4T-1-Ara h 2 before and after digestion with EcoR I and Not I

用限制性內切酶EcoRⅠ、NotⅠ雙酶切重組質粒pGEX-4T-1-Ara h 2，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如圖3所示。結果發現有一約500bp大小的酶切片段，與目的基因片段大小相符，另一片段為表達載體大小。測序結果表明，目的基因Ara h 2.02的編碼基因正確的融合到表達載體上，方向正確，無任何其他的外基因插入，可以確認構建成功。

2.5 表達產物的SDS-PAGE分析

圖4 重組質粒pGEX-4T-1-Ara h 2在BL21(DE3)RIPL中經不同時間誘導表達產物的電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of the bacterial lysates of BL21(DE3)RIPL harboring pGEX-4T-1-Ara h 2 induced with IPTG for different times

含pGEX-4T-1-Ara h 2重組質粒的BL21(DE3)RIPL經IPTG誘導后，在約46kD處有明顯的蛋白條帶，而未經誘導的陽性菌在此位置未見有目標蛋白。載體pGEX-4T-1所帶的標簽蛋白GST分子質量約為26kD，加上Ara h 2蛋白的分子質量，所表達的融合蛋白分子質量應為46kD。可見，融合蛋白分子質量與理論值相符。蛋白經不同時間誘導，其表達量也有所不同。通過Quantity One凝膠成像系統軟件分析結果顯示，融合蛋白經誘導表達2h后，其蛋白含量占總蛋白量的22.5%。當誘導時間增加，其蛋白含量略有減少，且隨著時間的不斷增加蛋白含量也在不斷降低。

2.6 GST-Ara h 2融合蛋白的純化

圖5 目標蛋白的純化電泳圖Fig.5 SDS-PAGE analysis of GST-Ara h 2 fusion protein purified from the bacterial lysates of BL21(DE3)RIPL harboring pGEX-4T-1-Ara h 2 after 24 h IPTG induction

超聲破碎細胞后，上清液通過Glutathione Sepharose 4B親和純化，結果如圖5所示。通過Quantity One凝膠成像系統軟件分析其純度約為90%，且每1000mL培養菌可獲得0.1mg左右的重組蛋白。

2.7 GST-Ara h 2融合蛋白的免疫印跡結果

圖6 融合蛋白的免疫印跡分析Fig.6 Western blotting analysis of the specific reaction of GST-Ara h 2 fusion protein with the anti-Ara h 2 sera from rabbits

純化的融合蛋白經轉膜后，與兔抗Ara h 2血清反應，在目標蛋白處有明顯特異性印跡，而與兔陰性血清反應無任何印跡出現，如圖6所示。該結果表明該重組蛋白具有良好的免疫反應原性。

3 討 論

對于大多數E.coli，密碼子AGG/AGA(arginine)、AUA(isoleucine)、CUA(leucine)、CGA(arginine)及 CCC(proline)使用率最低，被稱之為稀有密碼子。當帶有上述密碼子的外源基因mRNA在E.coli中表達，可能會導致翻譯終止或錯誤[8-10]。目的基因Ara h 2.02中含有大量的AGG/AGA稀有密碼子，其含量接近整個編碼基因的10%。因此，為有效表達該目的基因，選擇了添加了稀有密碼子的大腸桿菌BL21(DE3)codonPlus-RIPL作為表達宿主菌。研究結果表明，選擇的載體和宿主菌可以表達出Ara h 2，與理論分析一致。實際上相似的結果也被Lehmann等[11]證實，他們通過將克隆的Ara h 2基因與表達載體pET32a連接，并引入帶有編碼大腸桿菌精氨酸稀有密碼子AGG/AGA的tRNA基因pUBS520質粒，最后將該重組質粒轉入表達宿主菌E.coli Origami(DE3)中，也實現了Ara h 2蛋白的表達。

本研究利用基因重組技術克隆了Ara h 2.02基因，通過原核系統實現了體外有效表達，并采用親和純化獲得了高純度的Ara h 2融合蛋白。實驗中選擇pGEX表達載體，因純化條件溫和，整個過程無變性劑的加入，可最大限度地保持了蛋白的天然構象和活性。另外，由于GST標簽與目的蛋白之間設計了凝血酶(或Xa因子)的識別切割位點，使得純化后的融合蛋白即可將GST切下、去除，從而可得到無標簽的高純度目的蛋白。本實驗得到了純度較高的融合蛋白Ara h 2，但電泳結果顯示在目的蛋白下方位置還有個別條帶出現，這可能是因目的蛋白發生部分降解而導致，可通過實驗過程中盡量保持低溫操作及加入適量的蛋白酶抑制劑來改善。但由于目的蛋白大多數以包涵體的形式存在，使得所得的純化蛋白量很有限，可通過優化表達條件來盡可能的提高可溶性蛋白含量，或通過將包涵體變性復性的途徑來獲取更多目標蛋白。目的蛋白免疫印跡結果表明了該重組蛋白具有很好的免疫原性，可用于今后的相關研究。

此外，通過基因工程的手段生產重組蛋白是制備食物過敏原的重要途徑。重組食物過敏原不僅可以大量生產且具有高純度、品質穩定等優點，甚至可替代天然提取物用于靈敏性更高、特異性更強的食物過敏原的檢測[12]。大量文獻表明，重組食物過敏原在食物過敏原的檢測以及食物過敏的診斷與治療等方面都顯示了重要的價值，是天然過敏原的最佳替代物[13-14]。由于不同的表達體系對不同的外源基因會產生異樣的表達效果，加之Ara h 2編碼基因中含有大量的AGG/AGA稀有密碼子。因此，本研究工作只是一個初步探索，Ara h 2重組蛋白的原核表達體系，優化條件還值得進一步研究，甚至可以開展Ara h 2重組蛋白的真核表達工作。

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Preliminary Investigation on the Biosynthesis of Recombinant Peanut Allergen Ara h 2

HU Chun-qiu1,2，GAO Jin-yan1,3，LUO Chun-ping1,2，CHEN Hong-bing1,2,*，ZHU Pan1,2
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. School of Life Sciences and Food Engineering,Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Q786

A

1002-6630(2010)15-0203-05

2010-05-07

南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室目標導向項目(SKLF-MB-200807)；

江西省主要學科學術和技術帶頭人培養項目([2004]234號)；教育部新世紀優秀人才支持計劃項目(NCET-08-07-04)

胡純秋(1980—)，女，博士研究生，研究方向為食品營養與安全。E-mail：hchqiu@yahoo.com.cn

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向為食品營養與安全。E-mail：chbgjy@hotmail.com