屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌的污染途徑

李繼祥，高繼業(yè)，唐 妤，丁孟建，朱周福

(西南大學榮昌校區(qū)，重慶 402460)

屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌的污染途徑

李繼祥，高繼業(yè)，唐 妤，丁孟建，朱周福

(西南大學榮昌校區(qū)，重慶 402460)

目的：研究屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌的主要污染途徑。方法：以屠宰場生雞肉樣品為研究對象，在利用多聚酶鏈反應(PCR)檢測腸炎沙門氏菌污染的基礎上，通過流行病學的方法研究生雞肉污染與肉雞感染的關(guān)系。結(jié)果：屠宰場生雞肉樣品腸炎沙門氏菌污染陽性率為9.03%(26/288)，樣品污染與樣品來源屠宰場間無統(tǒng)計學聯(lián)系，但與養(yǎng)殖場的肉雞感染腸炎沙門氏菌有聯(lián)系；養(yǎng)殖場肉雞感染腸炎沙門氏菌與生雞肉污染有正的統(tǒng)計學聯(lián)系(相對危險性=18.5)；肉雞實驗性感染腸炎沙門氏菌后的帶菌時間可達42d，排菌達56d以上。結(jié)論：屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌的污染途徑主要為內(nèi)源性污染。

腸炎沙門氏菌；屠宰場生雞肉；污染途徑；內(nèi)源性污染

Abstract ：Objective: To explore main contamination pathways of raw chicken by Salmonella enteritidis in slaughterhouses.Methods: The contamination of Salmonella enteritidis in raw chicken samples from different slaughterhouses was detected by polymerase chain reaction (PCR). The relationship between the contamination of raw chicken and the infection of broilers was investigated. Results: A total of 288 samples from 5 slaughterhouses were detected, and the results showed that 9.03% of them were contaminated by Salmonella enteritidis. No significant difference was observed among raw chicken samples from different slaughterhouses; however, the number of contaminated samples was positively correlated with the infection of Salmonella enteritidis during the nursery of broilers (the relative risk was 18.5). The experimental infected broilers harbored Salmonella enteritidis for 42 days and the length of bacteria excretion was approximately 56 days. Conclusion: Endogenous contamination is the predominant contamination pathway by Salmonella enteritidis in raw chicken from slaughterhouses.

Key words：Salmonella enteritidis；raw chicken from slaughterhouse；contamination pathway；endogenous contamination中圖分類號：R155.5 文獻標識碼：A 文章編號：1002-6630(2010)15-0208-04

沙門氏菌是世界范圍內(nèi)最為重要的食物源性病原之一，30%食物源性細菌污染是由其引起的。沙門氏菌血清型眾多，對公共衛(wèi)生具有重要意義的是腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)。腸炎沙門氏菌有鞭毛，能運動，對人和動物有侵害性且引起多種不同臨床表現(xiàn)，主要通過污染禽肉和禽蛋來威脅公眾健康[1-2]。在美國，雞肉腸炎沙門氏菌污染越來越嚴重，2005年的污染陽性率比2000年提高了4倍[3]；法國和巴西的凍雞肉[4]、西班牙屠宰場的肉雞胴體[5]中腸炎沙門氏菌污染普遍存在；土耳其商店中銷售的生雞肉污染率為6.00%～33.33%[6]。在我國某些地區(qū)，腸炎沙門氏菌已成為危害肉雞養(yǎng)殖的主要病原性細菌之一，肉雞的感染率或發(fā)病率高達50%以上[7-8]，但生雞肉中腸炎沙門氏菌污染尚未見報道。腸炎沙門氏菌可通過外源性途徑和內(nèi)源途徑污染生雞肉，前者是指在屠宰、加工、銷售等過程中的污染，后者是指肉雞生前感染或攜帶病菌而導致的污染。本研究在利用多聚酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測屠宰場生雞肉中腸炎沙門氏菌污染的基礎上，利用流行病學方法研究污染的主要途徑，為采取合理措施降低污染程度提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生雞肉：于2007年12月至2008年3月從重慶、四川地區(qū)的5個肉雞屠宰場采集樣品，每個屠宰場采集6批，每批屠宰肉雞來源于同一養(yǎng)殖場，共采集了30個養(yǎng)殖場的樣品。生雞肉樣品為頸部皮膚復合物，在每批肉雞屠宰的前、中、后3個時間段分別抽取3～4只雞，每只雞采集30g左右。生雞肉樣品置于冰盒內(nèi)送檢。

Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、10×PCR 緩沖液、MgCl2(25mmoL/L)、dNTPs (10mmoL/L)、DL 2000 DNA Marker大連寶生物工程公司；核酸染料(Gold ViewTMNucleic Acid Strain) 賽百盛生物技術(shù)公司。

SOC培養(yǎng)基按文獻[9]配制。

1.2 方法

1.2.1 生雞肉中腸炎沙門氏菌的檢測

生雞肉樣品勻漿后置于盛有SOC培養(yǎng)基的三角燒瓶中，37℃空氣浴中振蕩培養(yǎng)16h，靜置5min，以上層菌懸液提取的細菌基因組DNA為模板進行腸炎沙門氏菌sefA基因的PCR擴增檢測[10-11]。

1.2.2 屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌污染的溯源調(diào)查

將檢測樣品按來源肉雞所屬養(yǎng)殖場進行統(tǒng)計并確定陽性樣品的來源場，將檢出陽性樣品的所有養(yǎng)殖場作為污染組，而其余養(yǎng)殖場為對照組。通過詢問和查閱養(yǎng)殖記錄等方式進行回顧性調(diào)查，搜集養(yǎng)殖場各種可能的危險因素。同時對各養(yǎng)殖場進行現(xiàn)場調(diào)查，了解存欄肉雞的健康狀況，并對出欄肉雞追蹤采樣檢測。根據(jù)回顧性和現(xiàn)場調(diào)查結(jié)果，推斷與屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌污染有聯(lián)系的危險因素。

1.2.3 養(yǎng)殖場肉雞感染腸炎沙門氏菌對生雞肉污染的影響

于2008年3月在某肉雞養(yǎng)殖地區(qū)，利用前瞻性實驗設計(即隊列研究)對養(yǎng)殖場肉雞感染腸炎沙門氏菌對生雞肉污染的影響進行研究。以細菌分離鑒定確診為腸炎沙門氏菌感染的8個三黃肉雞群組成暴露組[10]，由肉雞品種、日齡和飼養(yǎng)方式等相同的8個非感染雞群組成對照組；對暴露組和對照組各雞群進行追蹤采樣檢測。

1.2.4 肉雞實驗性感染腸炎沙門氏菌

將來源于沒有免疫腸炎沙門氏菌疫苗的健康三黃肉雞養(yǎng)殖場的受精卵在實驗室條件下孵化，飼養(yǎng)至10日齡用于實驗性感染。100只實驗雞隨機分為實驗組和對照組，每組50只，嚴格隔離飼養(yǎng)。實驗組每只雞經(jīng)口接種1mL腸炎沙門氏菌CQ0709株[7]菌懸液(相當于5倍 LD50劑量)，而對照組動物口服同等劑量滅活菌懸液。各組于實驗的第2、7、14、21、28、35、42、49、56天時隨機捕殺3只，分別采集頸部皮膚復合物、肝、脾和泄殖腔拭子進行腸炎沙門氏菌檢測。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

用卡方(χ2)檢驗對計數(shù)資料進行差異顯著性分析，相對危險性(relative risk，RR)=暴露組的樣品污染率/對照組的樣品污染率[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌污染

表1 屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌污染Table 1 Contamination of raw chicken by Salmonella enteritidis in different slaughterhouses

屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌污染的檢測結(jié)果見表1。從5個屠宰場采集的30批288份生雞肉樣品中檢出26份腸炎沙門氏菌污染樣品，樣品污染率為9.03%(26/288)。各屠宰場的樣品污染率分別為7.41%、11.48%、8.70%、8.93%和8.33%，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。從9批生雞肉樣品中檢出污染樣品，即屠宰場1的第1批和第4批、屠宰場2的第2批和第5批、屠宰廠3的第3批和第6批、屠宰廠4的第1批和第4批及屠宰場5的第2批樣品，而其余21批樣品均未檢出污染樣品。由于每批屠宰肉雞來源于同一養(yǎng)殖場，根據(jù)以上結(jié)果推測，屠宰場生雞肉腸炎沙門氏菌污染與肉雞養(yǎng)殖場有聯(lián)系。

2.2 對雞肉養(yǎng)殖場的回顧性和現(xiàn)場調(diào)查

污染組和對照組分別由9個和21個養(yǎng)殖場組成，所有養(yǎng)殖場均位于某肉雞養(yǎng)殖地區(qū)，其飼養(yǎng)方式、規(guī)模、肉雞品種、飼料、免疫接種等一致。污染組的肉雞生長速度比對照組慢，一般推遲7～10d出欄。污染組的各養(yǎng)殖場在以往的肉雞養(yǎng)殖過程中存在腸炎沙門氏菌感染，肉雞的發(fā)病日齡在7～50日齡、發(fā)病率在10%～20%左右，病死雞主要表現(xiàn)為肝、心和氣囊的纖維素性滲出性炎癥，而對照組的養(yǎng)殖場無該病流行。

在現(xiàn)場調(diào)查中，對照組的存欄肉雞沒有發(fā)現(xiàn)明顯的異常；污染組的存欄肉雞個體發(fā)育不整齊、約30%～40%的個體明顯低于正常標準，部分肉雞精神不振，排出白色稀糞，病理剖檢表現(xiàn)為心包膜增厚與心包積液，從肝組織中能分離出腸炎沙門氏菌。對污染組和對照組出欄肉雞追蹤檢測結(jié)果見表2。

表2 生雞肉腸炎沙門氏菌污染的追蹤調(diào)查Table 2 Tracking investigation of raw chicken contaminated by Salmonella enteritidis

由表2可知，從污染組的80份及對照組的175份生雞肉樣品中分別檢出21份和5份污染樣品，二者間差異極顯著(χ2=30.31，P＜0.01)。以上結(jié)果表明，與屠宰場生雞肉污染有關(guān)的危險因素是養(yǎng)殖場肉雞感染腸炎沙門氏菌。

2.3 養(yǎng)殖場肉雞感染腸炎沙門氏菌對生雞肉污染的影響

表3 肉雞腸炎沙門氏菌感染與生雞肉污染的關(guān)系Table 3 Relationship between broilers infected by Salmonella enteritidis and contamination of raw chicken

暴露組和對照組生雞肉中腸炎沙門氏菌檢測結(jié)果見表3。經(jīng)卡方檢驗，暴露組和對照組生雞肉腸炎沙門氏菌污染差異極顯著(χ2=11.7，P＜0.01)。暴露組和對照組的污染樣品率分別為25.33%(19/75)和1.37%(1/73)，由感染導致生雞肉污染的相對危險性(RR)為18.5。結(jié)果表明，養(yǎng)殖場肉雞感染腸炎沙門氏菌與生雞肉的污染有正的統(tǒng)計學聯(lián)系。

2.4 實驗性感染肉雞的帶菌和排菌時間

實驗組10日齡肉雞經(jīng)口接種5倍 LD50劑量的腸炎沙門氏菌后2d內(nèi)全部發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、食欲降低、兩翼下垂、不愿走動、腹瀉等臨床癥狀；死亡動物表現(xiàn)為纖維素性肝周炎、心包炎和氣囊炎，脾腫大，腸黏膜充血、出血、壞死等病變；12只死亡動物的肝、脾、皮膚復合物和泄殖腔拭子均檢出腸炎沙門氏菌，而不同時間捕殺動物的檢測結(jié)果見表4。對照組動物在實驗過程中未見明顯異常，捕殺動物采集的樣品均未檢測出腸炎沙門氏菌。結(jié)果表明，肉雞感染腸炎沙門氏菌后肝、脾和皮膚復合物的帶菌可達42d，從糞便排菌達56d以上。

表4 實驗性感染腸炎沙門氏菌的肉雞檢測Table 4 Detection of Salmonella enteritidis in experimental infected broilers

3 討 論

食品中沙門氏菌檢測的常規(guī)方法是建立在細菌分離鑒定的基礎之上，包括選擇性和非選擇性增菌培養(yǎng)、細菌分離、生化與血清學鑒定等5個步驟，具有費用高、操作復雜、費時等缺點，不適合批量樣品的檢測[13-14]。多聚酶鏈反應具有敏感性高、特異性強和快速等優(yōu)點，已用于動物性食品中多種病原性細菌的檢測[15-16]。SEF14菌毛是腸炎沙門氏菌特有的毒力因子，能使細菌牢固地附著于易感宿主消化道和生殖道的黏膜上皮細胞，從而引起宿主機體產(chǎn)生多種病理損傷。sefA是SEF14菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位，相對保守，其編碼基因(sefA基因)可作為PCR方法鑒定腸炎沙門氏菌的靶基因，即使用于肉品和禽蛋中腸炎沙門氏菌的檢測也具有很好的敏感性和特異性[11,17]。因此，在本研究工作中，選擇sefA基因的PCR擴增檢測作為生雞肉中腸炎沙門氏菌的檢測方法。

腸炎沙門氏菌作為沙門氏菌屬細菌的重要成員，主要寄居于人和動物，尤其是家禽的腸道，引起腸道病變，同時也可以導致腸道外其他臟器病變或全身性感染。就生雞肉腸炎沙門氏菌的污染而言，既可通過內(nèi)源性途徑(即肉雞在屠宰前感染)污染，也可通過屠宰、生雞肉的貯藏與運輸?shù)韧庠葱酝緩轿廴綶18-19]。本實驗采集了5個屠宰場的288份生雞肉樣品進行檢測，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌污染與屠宰場不存在統(tǒng)計學的聯(lián)系，但與肉雞來源的養(yǎng)殖場有關(guān)。由此推測，生雞肉的污染與養(yǎng)殖場中雞群腸炎沙門氏菌感染有關(guān)。回顧性調(diào)查、現(xiàn)場調(diào)查及存欄肉雞的追蹤檢測結(jié)果證明推測是正確的。為了進一步證實雞群感染腸炎沙門氏菌是導致生雞肉污染的主要途徑，本實驗還進行了前瞻性研究，其結(jié)果表明，雞群腸炎沙門氏菌感染與生雞肉污染有正的統(tǒng)計學聯(lián)系(RR=18.5)。綜上所述，屠宰場生雞肉中腸炎沙門氏菌的污染主要來自于肉雞感染導致的內(nèi)源性污染。

在本實驗調(diào)查地區(qū)，肉雞以農(nóng)戶飼養(yǎng)為主，養(yǎng)殖規(guī)模在5000羽左右，多采用墊料地面平養(yǎng)，普遍存在從業(yè)人員專業(yè)素質(zhì)低、飼養(yǎng)密度大、通風條件不良及不同日齡雞混養(yǎng)等問題，這為腸炎沙門氏菌的感染和再感染提供了有利的條件[20]。實驗性感染結(jié)果表明，肉雞感染腸炎沙門氏菌后的帶菌和排菌時間長，呈現(xiàn)持續(xù)性感染的特點，這與文獻[21]的結(jié)果一致。長時間排菌可導致動物群體中更多的個體感染與再感染，長時間帶菌直接導致感染雞屠體污染機會增加。因此，科學飼養(yǎng)，控制雞群腸炎沙門氏菌感染在防止生雞肉污染中具有重要作用。

[1] FOLEY S L, LYNNE A M. Food animal-associated Salmonella challenges:Pathogenicity and antimicrobial resistance[J]. Journal of Animal Science,2008, 86(14): 173-186.

[2] BOSILEVAC J M, GUERINI M N, KALCHAYANAND N, et al. Prevalence and characterization of Salmonellae in commercial ground beef in the United States[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009,75(7): 1892-1900.

[3] ALTEKRUSE S F, BAUER N, CHANLONGBUTRA A, et al. Salmonella enteritidis in broiler chickens, United States, 2000－2005[J].Emerging Infectious Diseases, 2006, 12(12): 1848-1852.

[4] HERNANDEZ T, SIERRA A, RODRIGUEZ A C, et al. Salmonella enterica serotypes isolated from imported frozen chicken meat in the Canary islands[J]. Jounal Food Protect, 2005, 68(12): 2702-2706.

[5] CAPITA R, ALONSO-CALLEJA C, PRIETO M. Prevalence of Salmonella enterica serovars and genovars from chicken carcasses in slaughterhouses in Spain[J]. Journal of Applied Microbiology, 2007, 103(5):1366-1375.

[6] GONCAGUL G, GUNAYDIN E, CARLI KT. Prevalence of Salmonella serogroups in chicken meat[J]. Turkey Journal of Veterinary Animal Science, 2005, 29: 103-106.

[7] 丁孟建, 高繼業(yè), 唐妤, 等. 肉雞源腸炎沙門氏菌的分離與鑒定及生物學特性觀[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2009, 36(5): 203-205.

[8] 黃素珍, 杜元釗, 張艷紅. 檢測腸炎沙門氏菌ELISA方法的建立與應用研究[J]. 中國預防獸醫(yī)學報, 2006, 28(2): 196-200.

[9] 奧斯伯F M, 布倫特R, 金斯頓R E, 等. 精編分子生物學實驗指南[M]. 顏子穎, 王海林, 譯. 北京: 科學出版社, 1999: 704.

[10] PAN Tzuming, LIU Yiju. Indentification of Salmonella enteritidis isolates by polymerase chain reaction and multiplex polymerase chain reaction[J]. Journal Microbiology Immunology Infection, 2002, 35(2):147-151.

[11] SZABO E A, MACKEY B M. Detection of Salmonella enteritidis by reverse transcription-polymerase chain reaction (PCR)[J]. International Journal of Food Microbiology, 1999, 51(1): 113-122.

[12] 劉秀梵. 獸醫(yī)流行病學[M]. 2版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2000: 121-129.

[13] VANESSA S, EDWARD T M, MICHAEL B. A comparison of standard cultural methods for the detection of foodborne Salmonella species including three new chromogenic plating media[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 123(1): 61-66.

[14] 中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與食品安全所. GB/T 4789.4—2008 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

[15] OLIVEIRA S D, SANTOS L R, SCHUCH D M T, et al. Detection and dentification of Salmonellas from poultry-related samples by PCR[J].Veterinary Microbiology, 2002, 87(1): 25-35.

[16] 李慧, 張會彥, 馬曉燕, 等. 改良FTA-PCR 快速檢測單核細胞增生李斯特氏菌的研究[J]. 食品科學, 2009, 30(6): 196-198.

[17] WOODWARD M J, KIRWAN S E S. Detection of Salmonella enteritidis in eggs by the polymerase chain reaction[J]. Veterinary Record,1996, 138: 411-413.

[18] QUESSY S. Control of Salmonella from farm to the table[C]//Eastern Nutrition Conference, Quebec City, Canada, May 8-9, 2003.

[19] HEYNDRICKX M, VANDEKERCHOVE D, HERMAN L, et al. Routes for Salmonella contamination of poultry meat: epidemiological study from hatchery to slaughterhouse[J]. Epidemiology Infection, 2002, 129:253-265.

[20] HOLT P S, GEDEN C H, MOORE R W, et al. Isolation of Salmonella enterica serovar Enteritidis from houseflies (Musca domestica) found in rooms containing Salmonella serovar Enteritidis-challenged hens[J].Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(19): 6030-6035.

[21] SADEYEN J R, TROTEREAU J, VELGE P, et al. Salmonella carrier state in chicken: comparison of expression susceptible and resistant animal[J]. Microbes and Infection, 2004, 14(6): 1278-1286.

Contamination Pathways of Raw Chicken by Salmonella enteritidis in Slaughterhouses

LI Ji-xiang，GAO Ji-ye，TANG Yu，DING Meng-jian，ZHU Zhou-fu
(Rongchang Campus, Southwest University, Chongqing 402460, China)

2009-12-24

重慶市自然科學基金項目(CSTC，2008BB1245)；西南大學科技服務資助項目(2007F002)

李繼祥(1968—)，男，副教授，博士，研究方向為動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生。E-mail：jxianglucky@126.com