米根霉L-乳酸發酵菌絲球形成條件的研究

蔣雪薇，羅曉明，盛燦梅，高必達

(1.湖南農業大學生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410004)

米根霉L-乳酸發酵菌絲球形成條件的研究

蔣雪薇1,2，羅曉明2，盛燦梅2，高必達1,*

(1.湖南農業大學生物安全科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410004)

研究米根霉CS323-9在搖瓶培養條件下影響菌絲成球及產乳酸的因素。考察(NH4)2SO4質量濃度、接種量、搖瓶轉速及表面活性劑吐溫-80用量4個因素，再利用L9(34)的正交試驗，對菌絲球形成及產酸的條件進行優化。結果表明：(NH4)2SO4質量濃度4g/L、接種量7%、搖瓶轉速200r/min、吐溫-80用量0.5g/L時，搖瓶發酵菌絲球數目達115個/mL、菌絲球平均直徑為1.2mm、L-乳酸積累量為78.9g/L。說明米根霉CS323-9在搖瓶培養條件下菌絲球的形成與乳酸的積累有較大的相關性。

米根霉；L-乳酸；菌絲球；正交試驗

Abstract：The effects of (NH4)2SO4 concentration, inoculum size, shake flask agitation speed and quantity of Tween-80 on the growht of Rhizopus oryzae mycelial pellets for L-lactic acid production were studied using shake flasks. Based on orthogonal array optimization, ammonium sulfate concentration of 4 g/L, inoculum size of 7% (V/V), shake flask agitation speed of 200 r/min and quantity of Tween-80 of 0.5 g/L were found optimum. The quantity of mycelial pelletswas up to 115 per milliliter after culture for 48 under these conditions, the average pellet diameter 1.2 mm and the yield of L-lactic acid 78.9 g/L. Our findings suggest that the grwoth of Rhizopus oryzae mycelial pellets is largely correlated with L-lactic acid production.

Key words：Rhizopus oryzae；L-lactic acid；mycelial pellets；orthogonal array design

乳酸又名2-羥基丙酸(2-hydroxy propanoic acid)，是具有光學活性的最小分子之一，具有D-型、L-型和DL-型3種構型，能廣泛應用于食品、醫藥和化學工業[1]。特別是近些年發現L-乳酸聚合形成的聚L-乳酸(PLA)具有可生物降解性以后，L-乳酸發酵呈現出巨大的應用前景[2-4]。米根霉因其能發酵積累高光學活性的L-乳酸而成為乳酸發酵的重要生產菌株。與細菌發酵不一樣的是，米根霉是好氧發酵，需要有適當的溶解氧才能積累乳酸。而米根霉在液體深層發酵中的菌絲形態多數情況下是以大塊菌絲團為主，這阻礙了氧的傳遞，對菌體的生物量及乳酸的積累都會有影響[5]。因此，研究發酵過程中菌體的形態變得尤為重要。

根霉在液體培養下菌體會呈現菌絲團塊、菌絲和菌絲球等生長形態，這些復雜的生長形態不光影響發酵液中氧的溶解，還會使發酵控制變得比較復雜且不易掌握，難以建立合理的發酵動力學模型[6-7]。根霉在某些情況下會自聚集成球，這種生長狀態有利于改善發酵液的流變學特性，能促進溶氧及菌體對營養物質的吸收和代謝，進而提高產酸。根霉在自聚集成球的狀態下，其發酵動力學特性較菌絲體簡單，便于模擬；另外，成球的根霉還有利于菌體的固定化，對研究固定化連續發酵生產L-乳酸具有極其重要的意義[8-10]。本實驗研究米根霉搖瓶發酵中影響菌絲球形成的一些因素，對于乳酸液體深層發酵中如何改善菌絲形態有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

米根霉(Rhizopus oryzae)CS323-9，由長沙理工大學微生物實驗室提供。

1.2 培養基

斜面培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基；麩皮培養基：麩皮按質量比1:1加水混勻后，取50g裝入500mL的三角瓶；搖瓶培養基(g/L)：葡萄糖110、(NH4)2SO42、KH2PO40.6、MgSO40.25、ZnSO40.088、CaCO310，pH值自然。以上培養基均采用121℃、20min濕熱滅菌；其中CaCO3在150℃、2h干熱滅菌后加入。

斜面培養：28℃、2～3d；麩曲培養：28℃、7d，制備1012個/mL的孢子懸液作為接種物；搖瓶培養：250mL的三角瓶中裝入50mL液體培養基，接種孢子懸液，28℃、160～240r/min培養48h。

1.3 分析方法[11]

還原糖：菲林滴定法；L-乳酸：EDTA定鈣法；總酸：酸堿滴定法。

1.4 菌絲球的計數及球徑的測定

采用計數器計出肉眼可見的菌絲球；隨機取20個菌絲球，側出球體的直徑，然后求出平均值。

1.5 菌體生物量的測定

采用烘干法[11]。取一定量發酵液過濾得菌絲，蒸餾水充分洗滌除去菌絲上包裹的CaCO3，105℃烘至質量恒定并稱量。

1.6 菌絲球形成及產酸條件的優化

在預試驗基礎上，選取對菌絲球形成及產酸影響較大的4個重要因素：(NH4)2SO4質量濃度、接種量、搖瓶轉速、吐溫-80用量為考察對象，開展單因素試驗，單因素考察變量以外的其他條件為：(NH4)2SO42g/L、接種量6%(V/V)、搖瓶轉速200r/min、吐溫-80用量0g/L，28℃，培養48h。在此基礎上采用L9(34)的正交設計，進一步考察各因素之間的協同作用，確定最佳菌絲成球及產酸條件，其因素水平表見表1。

表1 L9(34)因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度的(NH4)2SO4對菌絲成球及產酸的影響

(NH4)2SO4是一種速效氮源，又是一種生理酸性鹽，其被利用后培養的pH值會有所降低，而在微酸性條件下L-乳酸的積累水平較高，因此，以(NH4)2SO4作為氮源，有利于菌絲生長及L-乳酸積累[12]。故研究了不同質量濃度的(NH4)2SO4對米根霉CS323-9的菌絲成球及產酸的影響，結果見圖1。

圖1 不同(NH4)2SO4質量濃度對菌絲成球(a)和發酵指數(b)的影響Fig.1 Effect of (NH4)2SO4concentration on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

從圖1a可以看出，隨著(NH4)2SO4質量濃度的增大，菌絲球數目會出現較大的增幅，當(NH4)2SO4質量濃度達4g/L時，菌絲球數目達到最大，最后降為0(菌絲形成菌絲團塊及絮狀物，均計菌絲球數目為0)。

從圖1b可知，當菌絲球數目達到最高值時，L-乳酸積累量也達到了較高水平，此時還原糖最低，同時生物量也達到較高的水平，但隨著(NH4)2SO4質量濃度的進一步升高，在生物量保持較高水平時，總酸維持較高水平的同時L-乳酸的積累量卻下降了。其原因可能與(NH4)2SO4是速效氮源，當質量濃度在一定的范圍內增大時，有利于促進菌絲生長，孢子聚集成團時，先萌發的菌絲由于生長迅速，將后萌發的孢子包裹在菌絲團中，就形成菌絲球；當(NH4)2SO4質量濃度過大時，菌絲生長速度快且量多，故而容易形成菌絲團塊，過大的菌絲團塊會使其核心的菌絲在營養物質及溶氧的傳遞上出現困難，反而抑制了L-乳酸的積累，轉為積累雜酸，致使乳酸產量急劇下降。因此，最佳的(NH4)2SO4質量濃度為4g/L。

2.2 不同接種量對菌絲成球及產酸的影響

圖2 不同接種量對菌絲成球(a)和發酵指數(b)的影響Fig.2 Effect of inoculum size on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

由圖2可知，接種量對菌絲球的形成及發酵周期都有很大影響[9]。接種量從5%增加到9%時，菌絲球數目及產酸到7%時同時達到最高。當接種量比較小時，菌絲球大而疏松，且菌絲球數少，當接種量為9%時，菌體大量生長，但菌絲球極小，僅肉眼能見，同時有大量的菌絲體存在，培養液呈現絮粥狀，菌體與培養液很難分離；接種量為7%時，菌絲成球數最大，且球體致密均勻，生物量也最大。這主要是因為接種量低時，單位體積的孢子數目少，導致聚集的孢子團較少，形成的菌絲核心也就少，加之生成的菌絲量少，所以每個核心上纏繞的菌絲也就少，故最終菌絲成球數少；相反，適當提高接種量，形成的孢子團多，菌絲核心也多，每個核心上纏繞的菌絲相對來說比較多，因而形成均勻致密的菌絲球。接種量過大時，菌絲之間競爭生長空間[6]，則容易給成球造成干擾，反而使菌絲球數目減少。接種量為7%時，菌絲球數目最大且L-乳酸產生量最大，故最佳接種量為7%。

2.3 不同搖瓶轉速對菌絲成球及產酸的影響

米根霉L-(+)-乳酸發酵屬好氧發酵，為進一步考察菌絲成球及產酸與氧的需求的關系，研究了回旋式搖床在160～240r/min之間5種不同搖瓶轉速對菌絲成球及產酸的影響，結果見圖3。

由圖3a可知，當轉速小于200r/min時，隨著轉速的增加，其菌絲成球數略有增加。轉速較低時，形成的菌絲球因自重而沉降，且菌絲球間相互交聯，因而形成不規則的絮狀菌絲帶；當轉速為200r/min時，菌絲成球數達最大值；當轉速大于220r/min時，由于轉速過大，大量菌絲互相纏繞，不利于成球，導致成球數相對于200r/min來說要少很多。

圖3 不同搖瓶轉速對菌絲成球(a)和發酵指數(b)的影響Fig.3 Effect of shake flask agitation speed on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

由圖3b可知，當轉速達到240r/min時，L-乳酸積累量急劇下降，總酸也略有降低，而還原糖則維持較高水平，同時生物量也處于較低水平。說明盡管米根霉L-(+)-乳酸發酵是好氧的，但不是通氣量越大越好，通氣過大一方面葡萄糖代謝旺盛，TCA循環加強，富馬酸等代謝副產物增多[13]；另一方面會增加乳酸的氧化分解，產生其他副產物，導致總酸下降。因此，有利于菌絲成球及產酸的最佳轉速為200r/min。

2.4 不同表面活性劑添加量對菌絲成球及產酸的影響

發酵液中適量添加表面活性劑可以改變發酵液流變學特性[7]。由前期實驗發現非離子型表面活性劑吐溫-80在培養過程中有利于改善菌絲的形態及產酸。故考察了添加不同量的吐溫-80時，搖瓶發酵菌絲球形成及產酸的情況，結果見圖4。

由圖4可知，當吐溫-80的添加量為1g/L時，菌絲球的數目達到最大，且產酸最高、還原糖最低，但當吐溫-80的添加量進一步增加時(＞1g/L)，總酸及L-乳酸積累量下降較大，還原糖量較高且生物量也有所減少。這可能與吐溫-80是非離子型表面活性劑，能改變發酵液中孢子和菌絲球液膜表面張力，可適度消除菌絲成團的障礙，有利于孢子和菌絲聚集成球；添加量較高時，容易導致孢子過多聚集，萌發時形成菌絲團塊，而不易成球，致使發酵液流變學特性變化，不利于產物積累。因此，吐溫-80的最佳添加量為1g/L。

圖4 吐溫-80的用量對菌絲成球(a)和發酵指數(b)的影響Fig.4 Effect of quantity of Tween-80 on the growth of Rhizopus oryzae mycelial pellets and fermentation parameters

2.5 正交試驗確定最佳菌絲成球及產酸條件

以上研究了幾個對菌絲成球影響較大的單一因素，但是，單因素試驗不能很好地反映出各因素之間的相互作用關系，為進一步對米根霉CS323-9的菌絲成球及產酸條件進行優化，選用L9(34)的正交試驗設計進行優化，結果見表2。

表2 L9(34)正交試驗結果[8]Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

從表2可以看出，通過直觀分析：各因素對L-乳酸積累量影響的主次順序是D＞A＞C＞B；對于菌絲球數，其影響次序為D＞C＞B＞A。菌絲球數的結果差異相當大，尤其是試驗號1、3、9，菌絲球的形成很少甚至沒有，菌絲主要以團塊或絮狀物的形式存在。菌絲團塊使菌絲內部的營養物質及氧的供給受到限制，菌絲生長僅局限于表面，使參與發酵的生物量減少，從而影響產物積累；而絮狀菌絲在攪拌發酵過程中容易被打斷，致使發酵液黏度升高，也會影響傳質[14-15]。米根霉L-乳酸發酵對于營養物質及氧的傳遞比較敏感，條件控制不好時容易產生過多的乙醇、富馬酸等副產物，影響L-乳酸的積累。而菌絲的形態直接影響了發酵液的流變學特性和發酵過程的傳質效能，進而影響乳酸的生成和糖的消耗速率等重要發酵指標。因此，菌絲球數的多少與產酸有著較大的協同關系，可以看出，菌絲球數較少或沒有的L-乳酸積累量也相對較低，而菌絲球數目較多的其L-乳酸的積累量也明顯高于前者。基于絲狀菌發酵中菌絲形態的變化對于發酵指標變化的重要影響，選取以菌絲球數為指標的分析結果確定其影響的主次順序，其最佳條件組合為D2C2B2A2，即吐溫-80用量0.5g/L、搖瓶轉速200r/min、接種量7%、(NH4)2SO4質量濃度4g/L。

4個因素中表面活性劑吐溫-80的用量無論是對于L-乳酸積累還是產物形成都有著較大的影響，這可能與吐溫-80能有效改變發酵液的表面張力，從而改變溶氧及孢子聚集程度有關。影響L-乳酸積累量的第二因素是(NH4)2SO4質量濃度，這可能與(NH4)2SO4對菌絲生長有較大的影響有關，(NH4)2SO4質量濃度較高時，所獲生物量也較高，L-乳酸是生長偶聯型發酵，生物量較高時，L-乳酸積累量也隨之提高；而影響菌絲成球的第二因素則是搖瓶轉速，搖瓶轉速對孢子萌發后不斷延長的菌絲的纏繞形式有較大的影響，從而影響菌絲的形態。綜合考慮，在生物量較大、菌絲成球數目較多時，L-乳酸積累量比較高，可以說，菌絲形態對于米根霉L-乳酸發酵來說也是一個非常重要的因素。

2.6 最優條件的驗證實驗

圖5 試驗號4(a)和最優化條件(b)實驗的菌絲球形態Fig.5 Comparison of morphological pictures of Rhizopus oryzae mycelial pellets formed under different culture conditions: a. run 4 (see Table 2); b. ammonium sulfate concentration of 4 g/L, inoculum size of 7% (V/V), shake flask agitation speed of 200 r/min and quantity of Tween-80 of 0.5 g/L

以正交試驗所得的最優化條件進行驗證實驗，搖瓶發酵平均產L-乳酸為78.9g/L，菌絲球生成數目為115個/mL，其菌絲球形態與正交試驗4號試驗組對比見圖5。兩組實驗所得的產酸都比較高，且菌絲球形成數目也較高，從試驗號4的照片(圖5a)可以看出其菌絲球直徑較大，平均達3.3mm，培養基中除菌絲球外還有少量絮狀的菌絲體，而最優條件下的實驗照片(圖5b)則菌絲體較少，球的直徑較小，平均為1.2mm，且菌絲球較4號致密，發酵液比較清稀，這樣的培養液有利于營養物質及氧的傳遞，因而產酸有所提升。

3 結 論

3.1 研究了菌絲成球的影響因素，并探討了菌絲成球與L-乳酸的積累關系，研究證明，菌絲球的形成有助于改善發酵液的流變學特性，有利于氧及營養物質的傳遞，從而有利于產酸。

3.2 促進菌絲球形成及搖瓶產酸的最佳條件：吐溫-80用量0.5g/L、搖瓶轉速200r/min、接種量7%、(NH4)2SO4質量濃度4g/L。其中吐溫-80用量及搖瓶轉速對菌絲球形成及產酸都有比較大的影響。在此條件下平均產酸達78.9g/L，菌絲球數目為115個/mL，球體平均直徑為1.2mm。

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Effects of Culture Conditions of Mycelial Pellet Formation and L-Lactic Acid Production by Rhizopus oryzae

JIANG Xue-wei1,2，LUO Xiao-ming2，SHENG Can-mei2，GAO Bi-da1,*
(1. College of Bio-safety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China；2. College of Chemical and Biological Engineering, Changsha University of Science and Technology, Changsha 410004, China)

TQ921.3

A

1002-6630(2010)15-0216-05

2010-05-07

湖南省教育廳資助項目(06C090)；微生物分子生物學湖南省重點實驗室開放基金項目(MM0802)

蔣雪薇(1972—)，女，副教授，博士研究生，研究方向為工業微生物發酵及食品生物技術。E-mail：jxw_72@sina.com

*通信作者：高必達(1952—)，男，教授，博士，研究方向為應用微生物學。E-mail：bdgao@yahoo.com.cn