芹菜素對3T3-L1前脂肪細胞增殖及分化作用研究

于華強，籍保平*，柳 嘉，周 峰，高豐衣，蘇春元

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

芹菜素對3T3-L1前脂肪細胞增殖及分化作用研究

于華強，籍保平*，柳 嘉，周 峰，高豐衣，蘇春元

(中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083)

目的：研究芹菜素(apigenin，AP)對3T3-L1前脂肪細胞增殖及分化的影響。方法：采用3T3-L1前脂肪細胞，利用MTT比色分析法檢測不同質量濃度芹菜素對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響；采用傳統的雞尾酒誘導劑誘導分化3T3-L1前脂肪細胞，利用油紅O染色檢測，通過比色分析法檢測不同質量濃度芹菜素對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響。結果：30、50μg/mL芹菜素相對于空白組和陽性對照組能夠顯著抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化，提示其可能具有預防肥胖的作用。

芹菜素；3T3-L1；增殖；分化；肥胖

Abstract：Objective: To investigate the effect of apigenin on proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes.Methods: 3T3-L1 preadipocytes were used as target cells to explore the effect of apigenin on their proliferation measured by MTT assay. Besides, cell differentiation using differentiation cocktail, oil red O staining and spectrometric determination were carried out for investigating the effect of apigenin on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes. Results: Apigenin at 30μg/mL and 50μg/mL concentrations could inhibit the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes in comparison with the blank group and the positive control group (established using Dulbecco s modified Eagle s medium containing 0.5 mmol/L IBXM,1μmol/L dexamethasone and 10μmol/L insulin). Conclusion: Apigenin appear to have potential for the prevention of obesity.

Key words：apigenin；3T3-L1 preadipocytes；proliferation；differentiation；obesity

肥胖主要是由于能量攝入和消耗失衡引起的代謝紊亂綜合癥，可引起體內脂肪過多的堆積或異常，從而影響整個機體的正常生理功能，增加動脈粥樣硬化、冠心病、高血壓、糖尿病、腫瘤、高血脂等疾病的發病危險[1-4]。2005年公布的“中國居民營養與健康狀況調查”顯示，我國兒童肥胖者為8.1%，成人超重和肥胖者分別為20%和10%。與1992年資料相比，成人超重率上升39%，肥胖率上升97%[5]。同時，在西方發達國家，各國在肥胖及并發癥的治療方面投入的經費占衛生總經費的5%～10%，每年高達數千億美元。因此，開發和利用具有減肥作用的功能食品，對提高肥胖人群的生活質量，保護人體健康具有重要的現實意義。

芹菜素(apigenin，AP) 是天然存在的一種黃酮類化合物，化學結構為4′,5,7 - 三羥黃酮，廣泛存在于水果、蔬菜、豆類、茶葉中[6]，而芹菜含量最高。體外研究或動物實驗顯示芹菜素具有多方面的藥理作用，例如其具有明顯的抗腫瘤作用[7-13]、抗氧化作用[14]、降血壓和舒張血管預防動脈粥樣硬化作用[15]以及保護中樞神經系統等作用[16]。因此，芹菜素對健康的影響已引起廣泛關注，成為營養學及藥理學研究的熱點。

本實驗采用3T3-L1前脂肪細胞，利用MTT比色分析法研究不同質量濃度芹菜素對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響；并進一步采用傳統的雞尾酒誘導劑誘導分化3T3-L1前脂肪細胞，利用油紅O染色，通過比色分析法研究不同質量濃度芹菜素對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響；從抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化兩個方面研究芹菜素預防肥胖的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3T3-L1前脂肪細胞 中科院上海細胞所；胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養液 美國Gibco公司；MTT、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素(Insulin)、地塞米松(DEX)、胰蛋白酶 美國Sigma公司；油紅O染料 上海化學試劑廠；青霉素-鏈霉素溶液(100×) 碧云天生物技術研究所。

1.2 儀器與設備

XDOS-1B倒置生物顯微鏡 重慶光電有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；MCO-15ACCO2培養箱(37℃) 日本Sanyo公司；TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；Multiscan MK3自動酶標分析儀 美國Thermo公司；DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 試劑的配制

MTT溶液：稱取50mg MTT溶于PBS溶液中配制成5mg/mL MTT溶液，過濾后4℃避光保存兩周內有效，避免反復凍融，最好小劑量分裝，避光保存。

胰島素溶液：最終培養基中胰島素的質量濃度為10μg/mL。酸化水的配制：4.9mL的注射用水加0.lmL的濃鹽酸混合備用。工作液的配制：稱取胰島素2.5mg溶于1mL酸化水中，得到胰島素2.5mg/mL的工作液，分裝－20℃保存備用。避免反復凍融。

地塞米松溶液：最終培養基中地塞米松的濃度為1μmol/L。工作液的配制：稱取地塞米松溶于無水乙醇溶液，終質量濃度為5mg/mL (12700μmol/L)，取上述溶液10μL加入990μL注射用水得到地塞米松0.05mg/mL(127μmol/L)的工作液，4℃保存備用。

IBMX：最終培養基中IBMX的濃度為0.5mmol/L。工作液的配制：稱取IBMX 5mg，溶于100μL DMSO得到IBMX 0.225mol/L的工作液，－20℃保存備用。

誘導劑Ι：用DMEM完全培養基配制終濃度為0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松和10μg/mL胰島素的誘導劑。

誘導劑Ⅱ：用DMEM完全培養基配制終質量濃度為10μg/mL胰島素的誘導劑。

油紅O染料：稱取0.25g油紅O加入100mL異丙醇，50℃加熱助溶lh，冷卻后，過濾作為儲存液，使用時，取6份上述儲存液加4份雙蒸水混勻，靜置10min，即為使用液。

由表11中的各分析參數可知，F=840.7143遠遠大于Fcrit=5.192168，故由此證明不同調和比例油樣之間在該方法下凝點檢測結果差異顯著。P-value=2.97E-07，遠遠小于α=0.05，表明在置信度為95%時該結果可信。該方法能夠區分凝點不同的柴油。

1.4 3T3-L1前脂肪細胞的培養

將3T3-L1前脂肪細胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基(25mmol/L)中，37℃、5%CO2飽和濕度，1%雙抗條件培養，長滿80%時傳代。

1.5 3T3-L1前脂肪細胞的密度與MTT光密度值的對應關系

將3T3-L1前脂肪細胞置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，37℃、5%CO2飽和濕度，1%雙抗條件下培養。顯微鏡下觀察細胞已貼壁，呈梭形、透亮，換培養液，生長至接觸抑制時細胞用胰酶消化，吹打成單個細胞，計數，然后將細胞密度分別調整至1×l06、5×l05、1×l05、5×l04、1×l04、5×l03個/mL接種至96孔板，每個密度6個復孔，12h細胞貼壁后采用MTT法測定其光密度值，以得到3T3-L1前脂肪細胞細胞密度與MTT光密度值的對應關系。

1.6 細胞增殖活力檢測

活細胞線粒體中有與NADP相關的脫氫酶，可將黃色的四甲基偶氮唑藍(MTT)還原為不溶性的藍紫色結晶，用DMSO將藍紫色結晶溶解后，在550nm波長處用酶標儀檢測光密度值。

3T3-L1前脂肪細胞接種于96孔板，調整每孔細胞密度為5×103個/mL。常規培養12h，換以用DMEM培養液配制的芹菜素溶液200μL，芹菜素質量濃度分別為5、10、30、50、100μg/mL，陽性對照為3.4μg/mL羅格列酮，同時設空白對照組。每個實驗組設12個平行孔，連續培養2d。在此期間，分別在24h和48h時，于芹菜素各劑量組中分別選取6個平行孔加入20μL新鮮配制的5mg/mL的MTT培養液培養4h。將培養液吸干后，每孔加入200μL DMSO，輕輕振蕩10min溶解紫色結晶。酶標儀550nm波長處測定光密度值，觀察芹菜素對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響。

1.7 3T3-Ll前脂肪細胞株的誘導分化

將3T3-Ll前脂肪細胞接種于96孔培養板，使每孔細胞密度為5×104個/mL。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基在37℃、5%CO2培養，待細胞融合2d后，設一組空白對照組，正常加入誘導劑Ι；一組陽性對照組加入由誘導劑Ι配制的3.4μg/mL羅格列酮；各實驗濃度組加入由誘導劑Ι配制的質量濃度分別為5、10、30、50、100μg/mL的芹菜素，培養48h；換以用誘導劑Ⅱ配制的各組溶液，再培養48h，隨后以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基繼續培養，每2d換培養液一次[17]。

1.8 3T3-L1前脂肪細胞油紅O染色

油紅O是目前被認為最優良的脂肪染色染料，為脂溶性，在脂肪內能高度溶解，從而染色，并能保存組織細胞中的脂肪滴。

不同組的3T3-L1前脂肪細胞，用PBS洗3次，10%多聚甲醛固定細胞30min，PBS洗凈后將細胞晾干30 min，加入油紅O染液于細胞表面，靜置60min后用60%異丙醇洗細胞2次去除多余的染料。再以雙蒸水洗3～4次后。倒置顯微鏡下觀察結果，拍攝照片[18]。

1.9 3T3-Ll前脂肪細胞誘導分化過程中脂肪積聚的定量檢測

成熟的脂肪細胞含有脂肪滴，這些脂肪滴可被脂溶性的油紅O染料染成橘黃色或紅色。用異丙醇溶解脂肪細胞中的油紅O染料后，在550nm波長處用酶標儀檢測光密度值，可以定量檢測細胞內脂肪的含量，判斷脂肪細胞的分化程度。

已經完成油紅O染色的細胞，加異丙醇溶解油紅O，振蕩搖勻5min，用酶標儀在550nm的波長處測定各孔的光密度值[19]。

1.10 統計學處理

數據結果采用SPSS12.0軟件進行One-Way ANOVA分析，鄧肯氏多重檢驗用來確定數據間的顯著性差異，顯著水平設定為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 3T3-L1前脂肪細胞的密度與MTT光密度值的對應關系

MTT光密度值可以間接反映活細胞密度，由于3T3-L1前脂肪細胞生長曲線根據MTT光密度值制得，因此實驗分別采用不同密度細胞測定其MTT光密度值得到對應關系如表1所示。

2.2 3T3-L1前脂肪細胞生長曲線

圖1 3T3-L1前脂肪細胞生長曲線Fig.1 Cell growth curve of 3T3-L1 preadipocytes

由圖1可知，3T3-Ll前脂肪細胞以1×103個/mL開始培養，從第2天開始細胞開始快速增殖，至第4天增殖速度顯著降低，其中第2天開始快速增殖時細胞密度約為5×103個/mL，第2天到第4天為細胞對數增長期，因此評價不同質量濃度芹菜素對3T3-Ll前脂肪細胞增殖活力的影響時，細胞接板密度確定為5×103個/mL，培養時間確定為48h。

2.3 芹菜素對3T3-Ll前脂肪細胞增殖活力的影響

圖2 不同質量濃度芹菜素對前脂肪細胞增殖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of apigenin on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

MTT是一種能夠接收氫原子的化學染料，活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶解的藍紫色結晶并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在一定細胞數量范圍內，藍紫色結晶的形成量與細胞數量成正比，因而光密度值可以間接反映活細胞數量。由圖2可知，芹菜素對3T3-L1前脂肪細胞有明顯生長抑制作用，隨著其質量濃度的增加，其抑制細胞生長的作用逐漸加強。24h后，陽性對照組及各質量濃度實驗組OD值相對于空白組明顯降低，其中30、50μg/mL質量濃度實驗組細胞增殖分別比空白組低16.18%、17.64%，與陽性對照組相比具有顯著差異。48h后，陽性對照組及5、10μg/mL實驗組相對于空白組抑制增殖效果不明顯。30μg/mL質量濃度以上實驗組抑制作用明顯提高，相對于陽性對照組差異顯著。

2.4 芹菜素對3T3-Ll前脂肪細胞分化的影響

圖3 分化前脂肪細胞與分化后脂肪細胞Fig.3 Morphological mirographs of 3T3-L1 preadipocytes and adipocytes

表1 3T3-L1前脂肪細胞密度與MTT光密度值對應關系Table 1 Density of 3T3-L1 preadipocytes versus optical density in MTT assay

由圖3可知，誘導分化前的3T3-L1脂肪細胞呈典型的梭形，胞漿中無脂滴，形態與成纖維細胞相似。當細胞完全融合后，處于生長停滯，未見處于明顯分裂相的細胞，誘導分化第4天時，細胞變大、變圓，細胞中有脂滴出現。誘導分化第12天時，前脂肪細胞分化為成熟的脂肪細胞，表現為細胞胞漿豐富，含有大量的脂滴，脂滴分布于核周圍，形成“戒指環”結構，為典型的成熟脂肪細胞形態。

前脂肪細胞為纖維細胞，分化成熟的脂肪細胞形態為近圓形和圓形。二者最重要的區別是分化成熟的脂肪細胞能夠合成甘油三酯，進行脂質貯存。細胞質中出現多個小脂滴或者單獨一個大脂滴，將胞核擠在旁邊。油紅O可以與脂滴結合呈紅色，因此油紅O染色可以直觀反應脂肪細胞的分化程度。

圖4 不同質量濃度芹菜素對脂肪細胞分化的影響(油紅O染色)Fig.4 Effect of different concentrations of apigenin on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes (oil red O staining)

由圖4可知，經不同質量濃度芹菜素干預后，各組細胞分化不同程度被抑制。隨著芹菜素質量濃度的升高抑制作用逐漸加強，相對于空白組，芹菜素組：10μg/mL組細胞分化降低37.29%，30μg/mL組降低41.52%，50μg/mL組降低46.61%，100μg/mL組降低52.54%。質量濃度大于10μg/mL實驗組相對于陽性對照組分化程度顯著降低，差異顯著，提示芹菜素具有抑制脂肪細胞分化的作用。

3 討 論

3T3-L1細胞屬小鼠源的成纖維細胞系，是前脂肪細胞，經特殊的誘導分化劑作用后，可以分化為成熟的脂肪細胞。包括在形態學改變、細胞生長、多種脂肪代謝酶的表達、脂質積累等方面能充分展示體脂肪細胞的特點，是目前國內外進行脂肪細胞功能及糖脂代謝研究中使用最廣泛的細胞株之一[20-21]。抗肥胖主要原理為提高能量消耗，增加脂肪分解和氧化，減少能量攝入，減少前脂肪細胞分化和增殖，減少脂肪細胞脂肪合成。前脂肪細胞可轉化成為成熟脂肪細胞，因此抑制前脂肪細胞增殖和分化是抗肥胖的一個重要方法。

芹菜素作為一種天然存在的黃酮類化合物，其對腫瘤的化學預防作用及其機制已得到較為深入的研究，而近年來芹菜素的其他藥理藥效也得到日益廣泛的關注和研究。通過本實驗顯示芹菜素具有抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖和分化的作用，提示其可能具有預防肥胖的作用。然而，芹菜素藥理學作用的研究大多尚處于體外實驗和動物模型階段，許多作用機制仍不清楚，對芹菜素的研究還需進一步深入。

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Effect of Apigenin on the Proliferation and Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes

YU Hua-qiang，JI Bao-ping*，LIU Jia，ZHOU Feng，GAO Feng-yi，SU Chun-yuan
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

Q946.8

A

1002-6630(2010)15-0260-04

2010-02-01

于華強(1982—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：yhqiang2012@yahoo.com.cn

*通信作者：籍保平(1958—)，男，教授，碩士，研究方向為果蔬加工與功能食品。E-mail：jbping@cau.edu.cn