羊軟骨Ⅱ型膠原蛋白對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎抑制作用的研究

劉 媛，王 健，史忠林，張志勝

(1.河北北方學(xué)院食品科學(xué)系，河北 張家口 075000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

羊軟骨Ⅱ型膠原蛋白對(duì)小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎抑制作用的研究

劉 媛1，王 健1，史忠林1，張志勝2

(1.河北北方學(xué)院食品科學(xué)系，河北 張家口 075000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

目的：探討灌胃Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠體質(zhì)量和足底厚度的影響。方法：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，篩選出0.2mol/L CⅡ的最佳灌胃劑量為0.6mL/d；然后將小鼠隨機(jī)分為4組：正常組、預(yù)防組、治療組和模型組進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)；最后測(cè)定致炎前后不同時(shí)期各組小鼠的體質(zhì)量和足底厚度。結(jié)果：預(yù)防組和治療組小鼠體質(zhì)量呈先減少后增加趨勢(shì)，小鼠足底厚度分別從致炎12d和14d后呈明顯降低趨勢(shì)，且前者效果優(yōu)于后者，模型組小鼠致炎后體質(zhì)量增長受到抑制且足底厚度明顯增加。結(jié)論：灌胃羊軟骨CⅡ能明顯緩解佐劑性關(guān)節(jié)炎小鼠的炎癥反應(yīng)。

羊軟骨；Ⅱ型膠原蛋白；佐劑性關(guān)節(jié)炎；抑制作用

Abstracts ：Objective: To investigate the effect of intragastric administration of collagen II from sheep cartilage on the body weight and plantar thickness in mice with adjuvant arthritis. Methods: The optimal dosage of collagen II was screened using preliminary experiments. Mice were randomly divided into four groups, designated as control group (A), prevention group (B),treatment group (C) and model group (D). The body weight and plantar thickness in mice were measured at different time points before and after induction of inflammation. Results: The plantar thicknesses of groups B and C both began to markedly decrease from 12 and 14 days after inflammatory induction, respectively; the change trend of body weight initially decreased, followed by an increase. Group B was superior to group C in body weight recovery. However, body weight was inhibited but plantar thickness increased significantly after inflammatory induction in group D. Conclusion: Intragastric administration of collagen II can relieve inflammatory reaction in mice with adjuvant arthritis.

Key words：sheep cartilage；type II collagen；adjuvant arthritis；inhibition

膠原蛋白是人體組織中含量最豐富的蛋白之一，共分為19型。其中Ⅱ型膠原蛋白(typeⅡcollagen，CⅡ)在人和動(dòng)物的軟骨中含量最為豐富[1]，是透明軟骨的主要結(jié)構(gòu)性組分，許多軟骨性疾病的發(fā)生、發(fā)展都與CⅡ的結(jié)構(gòu)或功能異常密切相關(guān)，因此，CⅡ成為類風(fēng)濕性疾病研究中的熱點(diǎn)[2-4]。最為經(jīng)典、最為常用的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚5]是弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvantarthritis，AA)，常用于其發(fā)病機(jī)制的研究[6]。

國外學(xué)者[7-8]對(duì)灌胃CⅡ防治AA、Pristane關(guān)節(jié)炎、抗原性關(guān)節(jié)炎的作用進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)致炎前和致炎后灌胃CⅡ(5、50、500μg/kg bw·d，灌胃7d)均能減輕佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvantarthritis，AA)大鼠的炎癥程度，致炎前給藥的作用好于致炎后給藥。國內(nèi)學(xué)者也證實(shí)了口服雞源和牛源C Ⅱ能明顯減輕患鼠關(guān)節(jié)腫脹度，降低AA發(fā)病率，但對(duì)羊源C Ⅱ的預(yù)防和治療效果研究較少[9-10]。本實(shí)驗(yàn)采用預(yù)防和治療兩種方案灌胃羊軟骨CⅡ，測(cè)定致炎前后不同階段小鼠體質(zhì)量和足底厚度的變化趨勢(shì)，研究對(duì)小鼠AA抑制作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

KM系雄性小鼠(合格證號(hào)：8010078)，6周齡，160只，體質(zhì)量20g左右，購于河北省試驗(yàn)動(dòng)物中心；新鮮羊肋軟骨 保定市肉聯(lián)廠。

鹽酸胍 天津市福晨化學(xué)試劑廠；胃蛋白酶、Ⅱ型膠原蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品(雞劍狀軟骨) Sigma公司。

旋風(fēng)牌微型高速萬能試樣粉碎機(jī) 河北省黃驊市齊家務(wù)振興電器廠；LRH-1508生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器材廠；TGL-16G高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；JJ-1增力電動(dòng)攪拌器 金壇市恒豐儀器廠；ZK-82B真空干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；DYCZ-24D雙垂直電泳槽、DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；Delta320酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器上海公司；UV751GD 紫外-可見光分光光度計(jì) 上海光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 羊軟骨CⅡ的制備[11-12]

對(duì)羊軟骨進(jìn)行去除骨筋膜等前處理，再用鹽酸胍抽提蛋白多糖(每克軟骨加入10mL 4mol/L鹽酸胍)，在pH2.5～3、胃蛋白酶質(zhì)量濃度10mg/100mL的條件下進(jìn)行酶解，最后過夜鹽析，離心(10000r/min，4℃離心30min)所得絮狀沉淀即為CⅡ，純度為93.12%。SDSPAGE電泳結(jié)果顯示自提CⅡ與標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果一致。使用前將所提CⅡ溶解，配成0.2mol/L的中性溶液。

1.2.2 預(yù)實(shí)驗(yàn)

取100只體質(zhì)量20g左右的KM系小鼠，進(jìn)行灌胃0.2mol/L CⅡ的劑量篩選實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明0.6mL/d為最佳灌胃劑量[13]，采用該劑量進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 正式實(shí)驗(yàn)

再取60只小鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、預(yù)防組、治療組、模型組，每組設(shè)15個(gè)重復(fù)。每組除正常飼喂外，對(duì)照組每天灌胃生理鹽水，第31天于小鼠右(左)后足跖部注射生理鹽水0.1mL；預(yù)防組每天灌胃0.6mL CⅡ，第31天于小鼠右(左)后足跖部注射完全弗氏佐劑0.1mL誘導(dǎo)小鼠致炎；治療組前30天每天灌胃生理鹽水，第31天再對(duì)小鼠以同樣方法致炎，致炎后每天灌胃0.6mL C Ⅱ；模型組第31天同樣方法致炎，全程每天灌胃生理鹽水。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

小鼠體質(zhì)量的測(cè)定：于致炎前12h，致炎后第3、10、18、24天分別測(cè)定各組小鼠的體質(zhì)量。

小鼠足底厚度的測(cè)定：于致炎前12h，致炎后第6、12、14、18、24天分別測(cè)定各組小鼠左右足的足底厚度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)采用單因素四水平設(shè)計(jì)，采用SPSS軟件包的 Paired-Samples t Test程序，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 灌胃CⅡ?qū)π∈篌w質(zhì)量的影響

表1 正式實(shí)驗(yàn)全程小鼠體質(zhì)量變化情況Table 1 Change trend of body weight from 12 hours before until 24 days after inflammatory induction

由表1可見，對(duì)照組變化幅度不明顯；預(yù)防組在致炎后3d呈緩慢增加趨勢(shì)；治療組開始變化不明顯，在致炎后10d體質(zhì)量呈明顯增加趨勢(shì)；模型組呈先減少后緩慢恢復(fù)的變化趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)期末，預(yù)防組體質(zhì)量顯著高于其他3組，治療組顯著高于模型組，模型組明顯低于其他3組，說明致炎嚴(yán)重抑制小鼠的體質(zhì)量增長；預(yù)防組和治療組對(duì)小鼠體質(zhì)量的恢復(fù)均有促進(jìn)作用，并且前者效果更明顯。

2.2 灌胃CⅡ?qū)π∈笞愕缀穸鹊挠绊?/h3>

圖1 各階段小鼠右足底厚度變化趨勢(shì)Fig.1 Change trend of right foot plantar thickness from 12 hours before until 24 days after inflammatory induction

圖2 各階段小鼠左足底厚度變化趨勢(shì)Fig.2 Change trend of left foot plantar thickness from 12 hours before until 24 days after inflammatory induction

由圖1可見，小鼠右足(原發(fā)性炎癥一側(cè))變化趨勢(shì)：對(duì)照組變化幅度很小；預(yù)防組在致炎后12d開始有降低趨勢(shì)，直到14d后趨于平穩(wěn)，24d恢復(fù)正常；治療組在致炎后14d開始有降低趨勢(shì)，直到24d后恢復(fù)正常。由圖2可見，左足(繼發(fā)性炎癥一側(cè))變化趨勢(shì)與右足大致相同；模型組原發(fā)性一側(cè)致炎后顯著升高，18d后略有下降；繼發(fā)性一側(cè)變化不明顯。

3 討 論

RA主要侵犯身體各部位的大小關(guān)節(jié)，以小關(guān)節(jié)受損為主，致殘率高。RA的病因及發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，可能涉及到遺傳、感染、免疫功能失調(diào)、內(nèi)分泌紊亂等諸多因素。為了能夠深入研究RA發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)藥物療效，常需借助于建立一個(gè)動(dòng)物模型來進(jìn)行。目前雖有多種制備動(dòng)物模型的方法，如卵蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、MRL/Ipr小鼠自發(fā)性關(guān)節(jié)炎、TNF-α基因轉(zhuǎn)化動(dòng)物關(guān)節(jié)炎等，但是這些方法都有成功率低、模型建立時(shí)間長等缺點(diǎn)[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用完全弗氏佐劑，制造小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，并取得了良好的造模效果。

CⅡ作為一種自身抗原，在RA的發(fā)病過程中起重要作用。國外學(xué)者曾用雞肋軟骨來源的CⅡ?qū)A動(dòng)物模型和人類RA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)性治療研究和初步臨床觀察，并取得了一定療效[15]。本實(shí)驗(yàn)采用預(yù)防和治療兩種方案對(duì)AA小鼠灌胃羊軟骨CⅡ，通過觀察小鼠足底厚度和體質(zhì)量的變化，研究CⅡ?qū)π∈笞魟┬躁P(guān)節(jié)炎的抑制作用。小鼠足底厚度能間接反映致炎小鼠膝關(guān)節(jié)的腫脹度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灌胃羊軟骨CⅡ能明顯緩解AA小鼠的關(guān)節(jié)腫脹度，且預(yù)防組效果優(yōu)于治療組。致炎后小鼠的體質(zhì)量增長受到嚴(yán)重抑制，預(yù)防組和治療組對(duì)小鼠體質(zhì)量的恢復(fù)均有促進(jìn)作用，并且前者效果更明顯。

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Inhibitory Effect of Type II Collagen from Sheep Cartilage on Adjuvant Arthritis in Mice

LIU Yuan1，WANG Jian1，SHI Zhong-lin1，ZHANG Zhi-sheng2
(1. Department of Food Science, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China；2. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

TS201.2

A

1002-6630(2010)15-0268-03

2009-12-23

劉媛(1981—)，女，講師，碩士，主要從事功能性食品的研究與開發(fā)。E-mail：liuyuanwenwen1981@126.com