自體骨髓干細胞移植結合口服中藥治療慢性肝功能衰竭的研究

孔祥建

研究應用患者自體骨髓干細胞作為供體，在體外分離純化后移植至患者體內，使干細胞在肝臟中生長分化為具有功能的肝細胞［1-5］，使損傷的肝功能得以恢復和重構，為干細胞的進一步治療研究打下基礎。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 160例慢性乙型重型肝炎為我院住院患者，年齡22～68歲;診斷符合2000年病毒性肝炎防治方案診斷標準［6］。隨機分組120例患者行自體骨髓干細胞移植治療，40例患者作為對照，給予綜合基礎治療。所有治療患者在知情同意的情況下，簽定《知情同意書》，兩組基本情況均無顯著性差異。

1.2 排除病例 肝性腦病、消化道出血、重度感染或大量腹水等嚴重并發癥，半年內未使用過其他抗病毒藥和其他免疫調節劑。其他病毒感染、酒精性、藥物性肝病。

1.3 主要試劑及儀器 超凈工作臺(北京半導體設備一廠)：臺式低溫高速離心機(美國Heraeus公司);二氧化碳孵箱(美國Heraeus公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司)流式細胞儀(FACSCalrbur，美國BD公司)LCVPLUS血管造影儀(美國GE公司)。Percoll分離液(美國Sigma公司);DMEM培養基(美國Hyclone公司)。

1.4 骨髓干細胞的采集 患者行局部麻醉消毒，在無菌條件下，以18號骨髓穿刺針從髂后上棘進行穿刺，抽取骨髓50～10 ml，以4000 U肝素抗凝，避免污染。

1.5 骨髓干細胞的分離 參照文獻［7］的方法，患者骨髓離心去除脂肪層，用等量DMEM培養液稀釋骨髓，制成細胞懸液。將骨髓輕輕的加到密度1.073/ml的percoll分離液上，在室溫下1200r/min，離心25 min。吸取界面細胞層，用等滲鹽水洗脫，1500 r/min×5 min離心3次，等滲鹽水重懸細胞，鏡下計數所用細胞為1.0×107個ml，制成體積為10 ml懸液，置于37℃二氧化碳孵箱待用。

1.6 骨髓干細胞移植 患者在局部麻醉下，行肝動脈介入，在X線監視下，將分離的骨髓干細胞5×108～5×109/ml。通過導管從肝動脈緩慢給入病變部位。之后用10 ml等滲鹽水沖洗管腔。

1.7 口服中藥 大黃、蟄蟲、大腹皮、牛膝、莪術、三棱、檳榔、雞內金、桃仁、醋芫花、水蛭、虎杖、黃芩、甘草、黃芪、丹參、茵陳等隨證加減［8］。

1.8 肝功能檢查 對照組和移植組患者在移植后1、4、8、12周進行肝功能檢測，分別檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，總膽紅素(Tbil)，白蛋白(Alb)，凝血酶原活動度(PTA)等指標。在 1、4、8、12 周觀察腹水，食欲，體力，腹脹，睡眠等癥狀改善情況，及術后的不良反應情況。

1.9 統計學分析 采用t檢驗。

2 結果

2.1 自體骨髓干細胞移植結合口服中藥后患者肝功能的改變 自體骨髓干細胞移植后患者肝功能在移植1、4、8、12周后，肝功能明顯改善，和對照組相比有明顯差異，表明骨髓干細胞移植治療后，患者肝功能逐步改善，見表1。

表1 自體骨髓干細胞移植后肝功能改善()

表1 自體骨髓干細胞移植后肝功能改善()

注：ALT：丙氨酸氨基轉移酶;Tbil：總膽紅素;Alb：白蛋白;與未移植對照組比較，*t=4.82，P ＜0.05，#t=4.31，P ＜0.05，△t=5.39，P ＜0.05。

組別 ALT(U/L) Tbil(μmol/L) Alb(g/L)133.8±18.5 131.8±15.9 28.9±3.8移植組 136.5±11.7 121.9±11.1 28.1±3.9對照組 術后1周 132.7±22.1 133.1±19.3 27.9±4.1移植組 128.2±20.5 119.3±11.5 29.8±3.9對照組 術后4周 104.8±18.6 122.7±12.9 28.1±3.6移植組 115.3±13.3 112.5±11.3 30.9±34對照組 術后8周 091.4±20.80 114.3±12.5 29.0±3.5移植組 084.8±14.9 082.7±21.7 32.5±3.8對照組 術后12周 082.9±21.10 106.5±12.1 28.2±3.6移植組 068.5±12.6* 081.6±41.8# 32.5±3.5對照組 術 前△

2.2 自體骨髓干細胞移植結合口服中藥后患者凝血機制的改變：移植組在干細胞移植后PTA逐漸上升，由術前平均25.9%上升至術后12周的52.6%;而對照組患者沒有明顯改善，表明骨髓干細胞移植治療后，患者凝血機制有所改善。

2.3 自體骨髓干細胞移植對患者短期生存率的改變 患者在移植后1周的生存率為100%，在4周內死亡2例，生存率為98.0%：在12周內死亡6例，生存率95.0%。為移植患者在1周后，生存率下降至86.7%;4周后降至80.0%;12周后降至60.0%

2.4 自體骨髓干細胞移植結合口服中藥后患者癥狀的改善 移植后大多數患者有明顯的癥狀改善，移植后食欲改善者90例，體力好轉者64例，腹脹減輕者56例，興奮失眠18例，局部疼痛6例。

2.5 自體骨髓干細胞移植結合口服中藥后不良反應的發生情況 在120例移植患者中未發現嚴重并發癥，術后有輕度惡心6例，發熱8例。未見其他嚴重不良反應。

3 討論

干細胞分化為具有功能的組織細胞并應用于器官損傷的治療，是人們關注的熱點及追求的目標。研究表明，在肝損傷中，干細胞起著重要的作用，骨髓干細胞是肝細胞的重要肝外來源［9］，在特定環境下可分化成肝干細胞和肝細胞，參與肝功能的修復和重構［10］從而治療肝損傷，為探索骨髓干細胞在人類肝損傷的治療作用，本文在大量研究的基礎上，采用患者自體骨髓干細胞作為供體，在體外分離純化后移植患者至患者肝臟，使其在自身內環境下分化為肝細胞，替代損傷的肝細胞。觀察骨髓干細胞移植結合口服中藥［11］使損傷的肝功能得以恢復和重構。又可以避免免疫排斥反應，不必考慮組織相容性抗原的配型問題，具有良好應用前景。

研究發現患者在移植12周后，ATL逐漸降低，由平均136.5U/L降至68.5U/L;Tbil由平均121.9 μmol/L降至81.6 μmol/L;Alb逐漸升高，由平均28.1 g/L升至32.5 g/L;和對照組相比差異有統計學意義，結果表明骨髓干細胞移植治療后，患者肝功能明顯改善;移植組在干細胞移植后PTA逐漸上升，由術前平均25.9%上升術后8周的52.6%;表明骨髓干細胞移植治療后，患者凝血機制明顯改善。生存率移植組較對照組明顯升高。自體骨髓干細胞移植后大多數患者有明顯的癥狀改善，未發現嚴重并發癥。

本文中，初步探討了自體骨髓干細胞移植結合口服中藥治療對肝衰竭的療效可佳。但是，以后將對移植分化的細胞進行追蹤檢測，探討移植后自體骨髓干細胞在人受體肝臟內定植、生長分化為肝細胞的過程采用自體骨髓干細胞移植結合口服中藥治療肝衰竭，療效可佳，不存在免疫排斥反應，安全有效，價格低廉，具有良好前景。研究將為肝病治療打開嶄新途徑，為干細胞的進一步治療研究打下基礎。

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［3］姚鵬，胡大榮，王帥，等.自體骨髓干細胞移植治療慢性肝衰竭研究. 肝臟，2005，1(3)：171-17.

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［5］Teratani T，Yamamoto H，Aoyagi K，et al.Direct hepatic fate specification from mouse embryonic stem cells.Hepatology，2005，41(4)：836-846.

［6］Chinese Society of Infectious Diseases and Parasitology and Chinese Society of Hepatology of Chinese edical Association.The progamme of prevention and cure for viral hepatitis.Zhonghua Ganzangbing Zazhi，2007，8：324-329.

［7］中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會、肝病學分會.病毒性肝炎防治方案.中華肝臟病雜志，2007，8：324-329.

［8］李飛.方劑學(下冊).人民出版社，2002，5：1044-1045.

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［10］Teratani T，Yamamoto H，Aoyagi K，et al.Direct hepatic fate specification from mouse embryonic stem cells.Hepatology，2005，41(4)：836-846.

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