左旋四氫巴馬汀對大鼠海馬神經元細胞鈣超載損傷的保護作用

周亞光,蘇明華,楊光田

缺血性神經細胞損傷與細胞內過高的鈣離子水平密切相關。臨床上常通過抑制神經細胞內的鈣超載、維持細胞內的鈣穩態來控制和治療腦缺血性損傷。左旋四氫巴馬汀(L-tetrahydmpalmatine,l-THP)為中藥延胡索的主要成分延胡索乙素的左旋物。近年研究表明左旋四氫巴馬汀具有抗腦缺血再灌注損傷[1,2]、抗心律失常[3]、鈣拮抗[4]等作用。本實驗通過建立藥物誘導細胞鈣超載損傷模型,應用激光掃描共聚焦顯微鏡技術,觀察l-THP對海馬神經細胞中胞漿游離鈣的影響,并探討其保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組 乳鼠(出生1 d～2 d),雌雄兼用。由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。分為4組:空白對照組,l-THP 1μmol/L組,1-THP 10μmol/L組,1-THP 100 μmol/L組。

1.2 藥品和試劑 l-THP購自廣東省博羅先鋒藥業集團有限公司,溶于蒸餾水中配成l mmol/L母液,每次實驗時,把母液溶于D-HANKS液中,配成實驗所需濃度。Fluo-3/AM購自Sigma公司,用二甲基亞砜配成保存液,儲存于-20℃冰箱中。B27、多聚賴氨酸、Caffeine均購于 Sigma公司,胎牛血清、馬血清、DMEM/F12培養基為Gibco公司產品,其余試劑均為國產分析純。

1.3 主要儀器 激光掃描共聚焦顯微鏡系統InsightPlus(美國Meridian公司);Olympus IX-70倒置顯微鏡(Japan)。

1.4 新生大鼠海馬神經元培養[5]新生乳鼠冷凍麻醉后,無菌條件下分離海馬并置入冰冷D-HANKS液中。將細胞懸液滴在預先用50μg/mL多聚賴氨酸(Sigma,USA)包被的玻片上,并放入 35 mm培養皿中。于37℃ 、飽和濕度、5%CO2、95%空氣條件下培養,24 h后換維持培養基(DM EM/F12+B27培養基),然后每周換液 2次。于培養第5天加入 3μg/mL阿糖胞苷作用48 h,以抑制膠質細胞等非神經元的生長。

1.5 海馬神經元胞內鈣濃度([Ca2+]i)變化測定[6]于培養第7天時,將分離的細胞從維持培養基中換到標準人工腦脊液(ACSF液)中。隨后將海馬神經元細胞置于Fluo-3/AM(20 Umol/L的負載液中,于37℃孵育30 min。去除負載液,并洗滌3次。在光鏡下找到形態完整,突觸清晰的細胞,對其進行激光掃描測定。Fluo-3/AM被動擴散進入細胞后,被酯酶水解釋出Fluo-3,Fluo-3與Ca2+結合,受488 nm的激光激發而產生熒光,其熒光值與[Ca2+]i呈正相關,即以熒光值變化表示[Ca2+]i變化。在激光掃描共聚焦顯微鏡time series程序下對細胞XY平面進行掃描,間隔時間為2 s,共掃描120次。計算細胞XY平面內平均熒光強度,以平均熒光強度代表[Ca2+]i,以熒光值增高或下降百分比來衡量細胞內Ca2+含量變化。

2 結 果

2.1 1-THP對靜息狀態下[Ca2+]i的影響 將 Fluo-3/AM 標記的細胞置于標準人工ACSF中,于掃描第2次和第3次之間加入不同濃度的1-THP,對照組加入相同體積的生理鹽水。結果顯示應用1-THP,各加藥組的鈣熒光強度值與對照組比較無統計學意義。詳見表1。

表1 靜息狀態下各組神經元細胞的鈣熒光強度值(±s)

表1 靜息狀態下各組神經元細胞的鈣熒光強度值(±s)

組別 0 s 50 s 100 s 150 s 200 s 240 s Control 973.6±7.8 976.2±10.6 968.9±17.3 976.9±14.0 970.0±9.5 971.9±11.2 l-THP 1μmol/L 973.4±10.2 964.3±14.8 972.4±10.3 967.8±8.6 965.1±9.8 968.8±7.8 l-THP 10μmol/L 975.1±7.8 968.3±7.8 970.5±5.1 970.4±9.7 967.1±10.7 972.0±16.3 l-THP 100μmol/L 972.9±5.7 973.3±3.8 974.8±8.1 973.8±5.5 973.3±6.7 976.2±5.5注:與對照組比較 P＞0.05。

2.2 1-THP對KCl去極化致[Ca2+]i升高的影響 在盛有標準ACSF液的浴槽中加入標記細胞和相應濃度1-THP,對照組加入相同體積的生理鹽水。溫浴5 min后,開始掃描,并在第2次和第3次掃描之間加入終濃度為60 mmol/L的KCl,結果:對 照組 、lμmol/Ll-THP 、10μmol/Ll-THP 、100μmol/L l-THP峰值熒光強度增加,分別為(64.3±2.8)%、(46.3±3.1)%、(34.2±1.5)%、(20.8±1.2)%(n=6,P＜0.01)。l-THP對KCl引起的胞漿[Ca2+]i升高有抑制作用。

2.3 1-THP對咖啡因致神經元細胞胞漿鈣濃度升高的影響無鈣ACSF液(其配方中CaCl2,用EGTA代替)中加入標記細胞和相應濃度1-THP掃描,對照組加入相同體積的生理鹽水。溫浴5 min后,開始掃描,于掃描第2次與第3次之間加入10 mmol/L Caffeine。 結 果 對 照 組、lμmol/Ll-THP、10 μmol/L l-THP、1 00μmol/Ll-THP峰值熒光強度增加 ,分別為(53.9±4.3)%、(48.2±3.9)%、(44.3±4.6)%、(35.5±3.2)%(n=6,P＜0.05)。l-THP對 Caffeine引起的胞漿[Ca2+]i升高有抑制作用。

3 討 論

神經元胞內 Ca2+超載是缺血性腦損傷的關鍵因素[7,8]。缺血引起胞漿[Ca2+]i的增加來自于細胞外Ca2+內流,細胞內儲存Ca2+釋放以及胞漿Ca2+的外排能力下降。當Ca2+內流過多或胞內儲存Ca2+釋放過多,超出神經元對Ca2+的調節能力時,引起鈣超載。鈣超載可以通過激活氧化應激反應產生氧自由基、引起線粒體損傷以及激活蛋白激酶等三種途徑引起神經元死亡[9]。因此,預防損傷引起的細胞內鈣超載,能有效地防治缺血性腦損傷。

本實驗采用的2種神經元損傷模型均屬藥物誘導的鈣超載損傷模型。①過量KCl可使細胞去極化,開放電壓依賴性鈣通道引起細胞內鈣超載。②高濃度咖啡因可在細胞外無鈣的環境下,刺激神經細胞內的蘭尼啶受體(Ry R)調控的鈣池,引起胞內鈣的釋放,造成細胞損傷。對于兩種鈣超載模型。本研究運用激光掃描共聚焦顯微鏡技術動態、定量地研究了左旋四氫巴馬汀對海馬神經元細胞鈣超載的影響。結果顯示(1～100)μmol/L1-THP對靜息狀態下的細胞內鈣無影響,說明它不參與自發的外鈣內流和內鈣釋放,不影響靜息狀態下的細胞功能。低濃度的1-THPμmol/L可輕微抑制由KCl誘導的內鈣增多;當增加1-THP達100μmol/L時,可顯著抑制由KCl誘導的細胞內鈣增加,這種抑制作用與左旋四氫巴馬汀劑量有關。另外,當用Caffeine刺激細胞內鈣庫時,左旋四氫巴馬汀可抑制細胞的內鈣增多。因此,推測左旋四氫巴馬汀對兩種類型的神經元損傷模型所導致的鈣超載,均有保護作用。即不僅抑制電壓依賴性鈣通道開放所致的鈣內流,而且對鈣庫釋放鈣也有影響。由于左旋四氫巴馬汀對KCl誘導的鈣超載的抑制程度強于Caffeine刺激細胞內鈣庫誘導的鈣超載,表明電壓門控型鈣通道對左旋四氫巴馬汀的作用更敏感。

盡管本實驗發現左旋四氫巴馬汀能夠通過作用于電壓門控型鈣通道和細胞內蘭尼啶受體(Ry R)調控的鈣池,來減輕損傷誘導的神經元細胞內鈣超載。但由于中樞神經系統神經元膜上已成功地記錄出了 L、N、P、Q、R、T等 6種類型的電壓依賴型鈣通道,它們有各自不同的電生理學特征。左旋四氫巴馬汀具體作用于那種類型的電壓依賴型鈣通道以及如何干預這些電壓依賴型鈣通道還不清楚,仍需進一步的實驗研究證實。

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