鈣磷物質的量比對磷酸鈣骨水泥性能的影響

張 濤 高杰維 屈樹新李茂紅 翁 杰

(材料先進技術教育部重點實驗室，西南交通大學材料科學與工程學院，成都 610031)

鈣磷物質的量比對磷酸鈣骨水泥性能的影響

張 濤 高杰維 屈樹新＊李茂紅 翁 杰

(材料先進技術教育部重點實驗室，西南交通大學材料科學與工程學院，成都 610031)

本研究通過在磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement,CPC)固相配方中添加不同量的氯化鈣(CaCl2)，制備不同鈣磷物質的量比的CPC，研究不同鈣磷物質的量比對CPC性能的影響。測試CPC的初、終凝時間。將CPC體外模擬浸泡3 d和7 d，研究模擬生理條件下CPC的性能，分別利用X-射線衍射(XRD)、力學性能實驗機、掃描電鏡(SEM)等研究CPC相成分、抗壓強度和斷面微觀形貌。通過化學滴定測定浸泡液中氯離子濃度。結果表明：提高鈣磷物質的量比不會顯著延長CPC凝結時間；模擬浸泡液中的氯離子濃度處于正常生理條件的范圍內；隨鈣磷物質的量比的增加，水化后CPC的抗壓強度顯著提高，而經過體外模擬浸泡后，鈣磷物質的量比為1.67和1.80的CPC的抗壓強度明顯下降；具有較高鈣磷物質的量比的CPC體外模擬浸泡后，形成多孔結構、弱結晶類骨磷灰石的終產物。

磷酸鈣骨水泥；氯化鈣；鈣磷物質的量比

磷酸鈣骨水泥 (calcium phosphate cement，CPC)是由一種或多種磷酸鈣粉末均勻混合，與磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)、血清或水等液相混合后，在生理條件下可自固化、易塑型，具有優良生物相容性的無機骨修復材料[1-2]。因此，CPC可以用于粉碎性骨折及掌骨、指骨等不穩定骨折的治療和骨缺損的充填[3]，成為骨修復材料的研究熱點之一。

其中Biocement D是由Driessens等在1994年提出的一種配方[4]，具有一定的力學性能、合適的初、終凝時間以及起始原料易制備等優點，被廣泛研究和應用。但是，Biocement D的組成和相成分與自然骨尚存在一定差異，其鈣磷物質的量比為1.50，CPC在生理環境中的終產物為羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)，HA 的鈣磷物質的量比為1.67。而自然骨的鈣磷物質的量比(nCa/nP)為 1.71，結晶度為33%～37%[5]，因此，需要來自人體的Ca2+促使其向HA轉化，較低的鈣磷物質的量比將影響CPC向HA轉化的效率，給術后患者恢復造成影響。Ye等[6]用化學沉淀法合成了不同鈣磷物質的量比并含碳酸根的部分結晶磷酸鈣(PCCP)，用PCCP和無水磷酸氫鈣(DCPA)研制了新體系磷酸鈣骨水泥，隨著骨水泥中鈣磷物質的量比的增加，其抗壓強度顯著下降，主要是由于其中孔隙率的增加，骨水泥的結晶度隨鈣磷物質的量比的增加而增加。但由于原料中的磷酸鈣鹽是難溶性鹽，所研制的磷酸鈣骨水泥的孔隙尺寸主要分布在數百納米，缺乏適合細胞和組織長入的數百微米的孔隙[7]。

因此，本研究在CPC中添加不同量的可溶性氯化鈣(CaCl2)，不僅可作為調節骨水泥鈣磷物質的量比的鈣源，并且可以根據需要調整氯化鈣的粒徑，制備出具有不同鈣磷物質的量比的多孔CPC，并研究模擬生理條件下不同鈣磷物質的量比對CPC性能的影響。

1 實驗部分

1.1 不同鈣磷物質的量比CPC的制備及體外模擬研究

將 CaCl2過篩，粒徑控制在 20～37.5 μm，取不同量分別加入Biocement D[4]的固相成份中(將配方中DCPD改為DCPA)，可制得鈣磷物質的量比為1.60、1.67 和 1.80的CPC，未 添 加 CaCl2的Biocement D作為對照組。以PBS為液相，液固比為0.20 mL·g-1，分別將 4 組 CPC 固相 (1.0 g) 和液相(0.20 mL)均勻混合、塑型、37℃相對濕度 100%水化24 h。將制備好的樣品按照30 mL·g-1加入PBS浸泡，放入恒溫水浴振蕩器，恒溫(37℃)、振蕩速率100 r·min-1。分別于3 d和7 d取樣，每天換液30 mL，保存浸泡CPC樣品后的PBS。

1.2 性能表征

1.2.1 凝固時間的測定

采用Gilmore雙針法測量CPC的初凝時間(initial setting time，IT)和終凝時間(final setting time，FT)[8]，每隔15 s測1次，每組測3個樣本，進行統計學分析。

1.2.2 CPC 中 CaCl2的溶出

采用沉淀滴定法測定浸泡液 (PBS)中Cl-的濃度，表征CaCl2的溶出速率。因酸性條件下可消除PBS溶液中磷酸根離子的影響，本實驗采用酸性條件下進行測定的弗爾哈德法[9]。

1.2.3 抗壓強度

采用Instron 5567型力學性能實驗機(Instron，UK)分別測定水化24 h的CPC試樣，以及體外浸泡3 d和7 d的CPC試樣的抗壓強度，加載速度為 0.5 mm·min-1，試樣尺寸為 Ф 6 mm×12 mm。每組測 5個樣品取平均值，進行統計學分析。

1.2.4 微觀形貌

將體外浸泡7 d后的CPC樣品在120℃條件下烘干，切開得到自然斷面。用導電膠將樣品粘在銅托盤上，再進行噴金處理。用Quanta 200型掃描電子顯微鏡 (Scanning electron microscope，SEM，FEI，The Netherlands)觀察CPC樣品斷面微觀形貌。

1.2.5 CPC 相成分分析

將CPC水化24 h、體外浸泡3 d和7 d的CPC樣品研磨成粉末，采用X射線衍射儀(X-Ray diffraction，XRD，X′Pert型，Philips，The Netherlands)測試相成分。測試條件：Cu靶，電壓：40 kV，電流為40 mA，掃描范圍 2θ：20°～35°。

2 結果與討論

2.1 氯化鈣對CPC初、終凝時間的影響

圖1是不同鈣磷物質的量比CPC初、終凝時間變化圖。由圖發現，隨著CaCl2添加量的增大，CPC的初、終凝時間有一定的增加，但與對照組比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。有文獻報道，減小液固比、增大產物成核生長速率、增加產生化學鍵力連接時顆粒間距均可縮短CPC漿體的凝結時間[10]。CaCl2易溶于水，當CPC固相液相混合時，部分CaCl2會溶解在液相PBS中，并隨CaCl2添加量增大而增加，CaCl2作為起始固相成分之一，部分溶解在PBS中，實際增大了液固比，延長了CPC凝結時間。但由于CaCl2的最大添加量僅為14.4wt%，因此沒有顯著改變初、終凝時間。凝結時間是CPC的重要物理性能，決 定了手術可操作性。Khairoun等研究認為[11]，對于臨床應用，初凝時間在3～8 min；終凝時間應該小于 15 min。本研究中 1.50-CPC 和 1.60-CPC 的初終凝時間均符合要求，1.67-CPC 和 1.80-CPC 的初凝時間略大于8 min，但與空白實驗組相比沒有顯著性延長。

圖1 不同鈣磷物質的量比CPC的初凝和終凝時間Fig.1 Initial setting time(IT)and Final setting time(FT)of CPC with different Ca/P molar ratios

2.2 模擬生理條件下CPC的性能

2.2.1 氯離子濃度

圖2出示了浸泡液中氯離子累積濃度隨時間的變化曲線。由圖可見CaCl2在最初2 d溶解速率較快，隨時間推移，浸泡液逐漸進入CPC內部使得CaCl2逐漸溶解，氯離子的濃度曲線變得平緩，說明CaCl2溶解速率降慢。同一時間，鈣磷物質的量比高的CPC，由于其中添加的CaCl2較多，因此溶液中氯離子濃度較大。1.80-CPC的氯離子最大濃度為(0.02744±0.00173)mol·L-1，人體體液中的氯離子濃度為 0.103 mol·L-1,并且體液處在動態流動中[12]，所以不會形成局部氯離子濃度過高而對人體造成傷害。

圖2 不同鈣磷物質的量比CPC體外浸泡釋放氯離子累積濃度Fig.2 Cumulative concentration of Cl-from CPC with differentCa/Pmolarratiosafterimmersed invitro

2.2.2 抗壓強度

圖3是CPC水化24 h以及分別浸泡3 d和7 d的抗壓強度。由圖可見，水化24 h后，CPC的抗壓強度隨CaCl2的加入而提高，并隨添加量的增加而增加，1.80-CPC 和 1.67-CPC 的抗壓強度較對照組有顯著性提高，達到了(18.87±7.07)MPa 和(13.11±4.10)MPa。浸泡3 d后，對照組CPC抗壓強度較未浸泡的提高，達到(22.86±6.11)MPa，而添加 CaCl2的3組的抗壓強度不僅較對照組相比明顯減小，而且較各自未浸泡的基本未變或降低，隨著CaCl2添加量的增加降低愈明顯。浸泡7 d后，除1.80-CPC組外，其余各組CPC的抗壓強度均較各自未浸泡組有不同程度提高，1.60-CPC的抗壓強度最大，為(32.40±4.72)MPa，而 最 小的1.80-CPC 也 達 到 了(12.46±3.73)MPa。由于 CaCl2的添加，其溶解產生一定的孔隙，導致材料孔隙率增加，不規則缺陷增加了，可導致材料抗壓強度下降[13]。

圖3 不同鈣磷物質的量比CPC水化24 h(CPC-0)、分別浸泡3 d(CPC-3)和7 d(CPC-7)的抗壓強度(*P＜0.05)Fig.3 Compressive strengths of CPC with different Ca/P molar ratios after 24 h of hydration(CPC-0),and soaking in PBS for 3 d(CPC-3)and 7 d(CPC-7)(*P＜0.05)

2.2.3 SEM觀察

圖4是不同鈣磷物質的量比CPC在模擬浸泡7 d后的斷面SEM照片。從圖中可以發現，不同的鈣磷物質的量比對CPC微觀結構和晶體形貌影響明顯。隨著CPC鈣磷物質的量比的增加，CPC的斷面變得更加疏松多孔。圖4(a)和(b)顯示1.50-CPC和1.60-CPC的斷面形貌呈相對致密的結構，沒有較大孔隙。圖4(c)和(d)顯示1.67-CPC和1.80-CPC的表面存在著一些孔徑在數10 μm的孔隙，并且表面顆粒之間相對疏松。骨組織工程支架不僅要求材料具有良好的生物相容性和可降解性，而且對多孔結構有一定的要求[14]。這種多孔的結構將有利于骨水泥的降解和新生骨組織的長入[15-16]。在圖4各圖右上角為相應試樣的高倍SEM照片，顯示了不同鈣磷物質的量比CPC的晶體形貌。1.50-CPC的高倍SEM顯示一些較大的顆粒，這些顆粒可能是CPC起始原料或沉積的磷酸鈣。1.60-CPC的高倍SEM顯示晶體形貌以細小的針狀形貌為主，并且較1.50-CPC斷面形貌松散，沒有較大的顆粒存在，說明提高CPC的鈣磷物質的量比會促進各種CPC起始原料的溶解和再沉積。1.67-CPC的高倍SEM顯示晶體形貌是花瓣狀和片狀，并且已經均勻的分布在CPC的內部。1.80-CPC的晶體形貌為更加細小的花瓣狀。

圖4 不同鈣磷物質的量比CPC模擬浸泡7 d后的斷面微觀圖Fig.4 SEM images of the cross sections of CPC with different Ca/P molar ratios after soaking in PBS for 7 d

2.2.4 XRD 分析

圖5(A)是CPC水化24 h后的XRD圖，圖5(B)和圖5(C)分別是CPC模擬浸泡3 d和7 d后的XRD圖。由圖可見，水化24 h后各種CPC的主要成分為未轉化的α-TCP和DCPA以及新形成的HA，未見CaCl2和CaCO3的衍射峰，這是由于CaCl2和CaCO3的加入量少，并且在CPC的固液相混合、水化過程逐漸被溶解。隨著CPC鈣磷物質的量比增大，CPC的α-TCP和DCPA主極大衍射強度逐漸減弱，表明加入CaCl2導致CPC鈣磷物質的量比提高，可能加速α-TCP和DCPA向最終相HA轉化或溶解。

圖5 不同鈣磷物質的量比CPC的XRD圖Fig.5 XRD patterns of CPC with different Ca/P molar ratios

CPC 模擬浸泡 3 d 后，1.50-CPC 和 1.60-CPC 的XRD圖中仍然存在未轉化的α-TCP和DCPA的尖銳的衍射峰，新形成HA的衍射峰較寬；而1.67-CPC和1.80-CPC的XRD衍射圖譜以新形成HA較寬的衍射峰為主，1.67-CPC尚存在少量α-TCP的衍射峰 (如 2θ=34.2°和 30.7°)。CPC 浸泡 7 d 后，1.50-CPC和1.60-CPC的XRD衍射圖譜中α-TCP的衍射峰強度變弱，HA衍射峰強度增大，CPC成分逐漸向 HA 轉變；1.80-CPC 和 1.67-CPC的XRD 衍射圖譜中主要為HA較寬的衍射峰，和圖5(B)相比，HA的衍射峰(211)逐漸消失形成彌散的衍射峰，表明CPC結晶度進一步降低。由于CaCl2的加入，提高CPC的鈣磷物質的量比，高的鈣磷物質的量比利于CPC中α-TCP等原料向最終相低結晶度HA轉化。尤其體外模擬浸泡后，高的鈣磷物質的量比顯著促進磷酸鈣骨水泥向終產物羥基磷灰石轉化。根據文獻和推測，加入CaCl2的CPC在水化和模擬生理條件浸泡過程中，CPC各組分可能發生以下反應[17]：

表1是根據各種CPC的XRD圖通過軟件MDI Jade 5.0計算得到的CPC結晶度。水化24 h后，4組CPC的結晶度都為85%左右。體外模擬浸泡后，在同一時間點，隨著鈣磷物質的量比的增加，CPC的結晶度降低。隨著浸泡時間的延長，1.80-CPC和1.67-CPC的結晶度進一步下降，而 1.50-CPC和1.60-CPC結晶度略有增加。模擬浸泡7 d后，1.50-CPC 至 1.80-CPC 的結晶度分別為 74.57%、75.95%、52.18%和 45.17%，因此，體外模擬浸泡后，高的鈣磷物質的量比顯著降低磷酸鈣骨水泥的結晶度，與人體骨結晶度(33%～37%)[5]接近。

表1 不同鈣磷物質的量比CPC的結晶度Table 1 Crystallinity of CPC with different Ca/P molar ratios

根據文獻報道[18-20]，體外模擬浸泡后的1.67-CPC和1.80-CPC的XRD圖和自然骨的非常相似，均以弱結晶HA為主，在化學組成完全相同的情況下，無定形和低結晶材料具有更大的能量和反應活性，更容易降解、具有更好的生物活性。因此，推測這種在結構、結晶度等與自然骨的無機相成分類似的CPC的終產物可能具有較高生物活性和更容易降解。

XRD分析結果顯示，由于加入CaCl2，在CPC水化和體外浸泡過程中均可提供較多的Ca2+，根據上述化學反應方程式，當存在較多的Ca2+將促進CPC的起始原料DCPA和α-TCP的向CPC的終相HA轉化，并且隨著鈣磷物質的量比的增大，這種作用更加明顯。鈣離子和磷酸根離子聚集在材料表面使相應的離子濃度達到成核閾值，在位點形成晶核，隨后溶液中的鈣、磷酸根等離子在晶核上沉積使晶體長大[21]。鈣磷物質的量比越高，越容易達到成核閾值，形成更多的成核位點，促進HA形成。然而由于給予晶體生長的時間較短，晶體沒有充分在各個晶面長大，導致結晶度降低。隨著DCPA和α-TCP的溶解或轉化，導致各種鈣磷離子重新沉積，改變CPC晶體結構，將松散的CPC固相中的鈣磷鹽通過鈣磷離子的流動和沉積被緊密的束縛到一起，類似于“膠水”作用。因此可顯著的提高CPC抗壓強度。1.67-CPC和1.80-CPC水化后擁有較高的抗壓強度，利于植入初期提供適當的支撐作用，而在體外模擬浸泡后，形成與自然骨組織無機質類似的低結晶度的HA。同時，隨著加入CaCl2的溶出，在CPC中產生一定的孔隙，雖然導致其抗壓強度下降，但是利于新生組織的長入。

3 結 論

(1)通過添加不同質量比例CaCl2可以制備出具有不同鈣磷物質的量比的CPC，CaCl2的加入不會顯著的改變各CPC的初、終凝時間。模擬體外釋放的氯離子的濃度處于正常生理的范圍。

(2)隨著鈣磷物質的量比的增加，水化后的CPC的抗壓強度顯著提高。體外模擬浸泡之后，隨著CPC中的CaCl2溶出，鈣磷物質的量比為1.67和1.80的CPC的抗壓強度顯著降低。

(3)較高的鈣磷物質的量比會促進CPC的起始原料DCPA和α-TCP的溶解或向熱力學穩定的終相HA轉化，并且隨著鈣磷物質的量比的增大，這種作用更加明顯。體外模擬浸泡后，較高的鈣磷物質的量比顯著地影響CPC的相成分和降低其結晶度，形成以類骨弱結晶磷灰石結構為主的終產物。隨著CaCl2的逐漸溶出，在CPC內部形成了孔徑大約在數10 μm的孔隙，并且表面變得更加疏松。這種相成分和微觀形貌結構使CPC具有快速降解和優良生物相容性的特點。

[1]Safdar K,Emre T,Joseph I.Orthop.Clin.North.Am.,2000,31(3):389-398

[2]Burguera F,Xu K,Weir D.J.Biomed.Mater.Res.Part B,2006,77B:l26-l34

[3]Bai B,Jazrawi M,Kummer J.Spine,1999,24:1521-1526

[4]Driessens M,Boltong G,Bermudez O,et al.J.Mater.Sci.Mater.Med.,1994,5:164-170

[5]Sergay D.Materials,2009,2:399-498

[6]Wang X,Ye J,Wang Y.J.Chin.Ceram.Soc.,2007,35(12):1582-1586

[7]Sopyan I,Mel M,Ramesh S,et al.Sci.Technol.Adv.Mater.,2007,8:116-123

[8]Driessens F,Boltong G,Bermudez O.Mater.Sci-Mater.M,1991,4:503-508

[9]Huazhong Normal University(華中師范大學).Analytical Chemistry.2nd Ed(分析化學.2版).Beijing:Higher Education Press,1996.436-438

[10]SHEN Wei(沈 衛),LIU Chang-Sheng(劉昌勝),GU Yan-Fang(顧燕芳).J.Chin.Ceram.Soc.(Guisuanyan Xuebao),1998,26(2):129-135

[11]Khairoun I,Boltong G,Driessens F,et al.Biomaterials,1997,18:1535-1539

[12]Tadashi K,Hiroaki T.Biomaterials,2006,27:2907-2915

[13]ZHU Guang-Nan(朱廣楠),SUN Kang-Ning(孫康寧).J.Chin.Ceram.Soc.(Guisuanyan Xuebao),2008,36(3):383-386

[14]LUO Fang-Cong(羅方聰),YE Jian-Dong(葉建東).Bull.Chin.Ceram.Soc.(Guisuanyan Tongbao),2009,28(1):27-30,37

[15]Real P,Wolke G,Vallet M,et al.Biomaterials,2002,23:3673-3680

[16]HE Li-Ping(何莉萍),WU Zhen-Jun(吳振軍),CHEN Zong-Zhang(陳宗璋),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2004,20(3):273-277

[17]Sadao T,Chow C,Kiichi I.Biomaterials,1998,19:1593-1599

[18]YE Jian-Dong(葉建東),WANG Xiu-Peng(王秀鵬),BAI Bo(白 波),et al.J.Funct.Mater(Gongneng Cailiao),2008,2(39):271-274

[19]CHEN Fang-Ping(陳芳萍),WANG Kai(王 凱),LIU Chang-Sheng(劉昌勝),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(Wuji Huaxue Xuebao),2008,24(1):88-92

[20]ZHONG Ji-Pin(鐘吉品),LIU Xuan-Yong(劉宣勇),CHANG Jiang(常 江).J.Inorg.Mater.(Wuji Cailiao Xuebao),2002,17(5):897-907

[21]NING Jia(寧 佳),WANG De-Jia(王德佳),HUANG Wen-Hai(黃文旵),et al.J.Chin.Ceram.Soc.(Guisuanyan Xuebao),2006,34(11):1326-1330

Influence of Ca/P Molar Ratio on Performance of Calcium Phosphate Cement

ZHANG Tao GAO Jie-WeiQU Shu-Xin＊LI Mao-Hong WENG Jie
(Key Lab of Advanced Technologies of Materials,Ministry of Education,School of Material Science and Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu 610031)

The aim of this study is to investigate calcium phosphate cement(CPC)with different Ca/P molar ratios prepared by adding different amounts of calcium chloride (CaCl2).The initial setting time (IT)and final setting time (FT)were studied.X-ray diffraction (XRD),mechanical testing,and scanning electron microscope(SEM)were used to characterize the phase composition,compressive strength and the morphology of the fracture surface of CPC with different Ca/P molar ratios after soaking in phosphate buffer solution (PBS)for 3 days and 7 days,respectively.The chloride concentration in PBS was determined by Chemical titration to characterize the dissolution rate of calcium chloride.Results showed that the IT and FT of CPC were not improved significantly with the increase of the Ca/P molar ratios.The chloride ion in PBS was in the normal physiological range.The compressive strength was improved after hydration with increasing Ca/P molar ratios,and the compressive strength of CPC which Ca/P molar ratios were 1.67 and 1.80 decreased significantly after soaking in PBS.CPC with high Ca/P molar ratios formed the poor crystalline apatite with porous microstructure similar to those of the inorganic composition of bone.

calcium phosphate cement;calcium chloride;molar ratio of nCa/nP

TB321；O613.62;O614.23+1

A

1001-4861(2010)06-0957-06

2010-01-18。收修改稿日期：2010-03-17。

國家自然科學基金項目(No.30470484，50975239)；教育部新世紀人才基金項目(No.NCET-05-0797)資助。

＊通訊聯系人。E-mail：qushuxin@home.swjtu.edu.cn

張 濤，男，25歲，碩士研究生；研究方向：磷酸鈣骨水泥。