正交法優選麩炒枳實最佳炮制工藝

于曉黎， 林桂梅， 謝 君， 張 懷， 賈天柱，2*

(1.遼寧中醫藥大學，遼寧大連116600;2.遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧大連116600)

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis osbeck的干燥幼果［1］。始載于《神農本草經》，列為中品，具有破氣消積，化痰散痞之功。在分析枳實有效成分中發現橙皮苷、柚皮苷等黃酮苷類化合物為枳實抑制平滑肌收縮的主要有效成分，辛弗林等生物堿類化合物為其升壓、抗休克的主要有效成分［2］。上述成分含量的差異影響到藥材的品質。枳實歷代有多種炮制方法，然而僅麩炒收載在《中國藥典》2005版中，但其炮制工藝尚不夠規范，質量亦難以控制。因此，本試驗以辛弗林及總黃酮含量為考察指標，采用正交設計法，優選麩炒枳實的最佳工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 日本島津LC-20AT液相色譜儀(SPDM20A檢測器，LC-20AB泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動進樣器，CBM-20A數據轉換模器);島津LC-Solution色譜數據工作站;日立U-3010紫外分光光度計;METTLER AE240型十萬分之一分析天平(瑞士METTLER)，FA1004B電子天平(上海精密科學儀器有限公司)

1.2 試藥 生品枳實藥材經本校中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為蕓香科酸橙Citrus aurantium L.的干燥幼果;辛弗林對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號110727-200306);橙皮苷對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號110722-200613);甲醇為色譜純，水為純凈水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC法測定辛弗林含量

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18(5μm，200 mm×4.6 mm);流動相:甲醇-磷酸水溶液(含0.18%磷酸0.22%十二烷基硫酸鈉)(58:42);柱溫:40℃;流速:1 mL/min;檢測波長:275 nm;進樣量:10μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取辛弗林對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL含0.702 mg的對照品貯備液，精密吸取5 mL對照品貯備液，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得0.070 2 mg/mL的辛弗林對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取麩炒枳實樣品適量，粉碎為中粉，取約1 g，精密稱定，按中國藥典2005年版一部枳實項下供試品溶液制備要求操作，過0.45 μm 濾膜，備用［1］。

2.1.4 線性關系考察 精密吸取濃度為0.070 2 mg/mL 的辛弗林對照品溶液 1、5、10、15、20 μL，按2.1.1項下操作，以對照品的量對峰面積進行回歸分析，得回歸方程為 Y=31 623X－977.11，r=0.999 9，辛弗林在0.070 2～1.404μg的范圍內線性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 取辛弗林對照品溶液，在上述色譜條件下重復進樣6次，以峰面積計算RSD值為1.5%。

2.1.6 重復性試驗 取同批樣品6份，分別按樣品含量測定方法進行測定，結果RSD為1.6%。

圖1 麩炒枳實HPLC色譜圖

2.1.7 穩定性試驗 取供試品溶液，按樣品含量測定方法于 0、2、4、6、8、10、12、24 h 進行測定，結果辛弗林峰面積的RSD為1.9%，結果表明供試液在24 h內穩定。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密量取已知辛弗林含量的枳實樣品6份，分別精密加入辛弗林對照品適量，按供試品的制備方法制備各供試液，依法測定各樣品中辛弗林的含量，結果平均回收率為99.2%，RSD為2.7%。

2.2 分光光度法測定總黃酮含量

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品1.72 mg置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，即得0.034 4 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取麩炒枳實樣品適量，粉碎為中粉，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液10 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，搖勻，通過聚酰胺柱(60～90目，2.5 g，內徑1.5 cm，干法裝柱)，用水50 mL洗脫，棄去水液，再用甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，轉移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，稀釋25倍，備用。

2.2.3 線性關系考察 精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，照分光光度法(中國藥典2005年版一部附錄Ⅴ)，以試劑空白作參比，在283 nm處測定吸收度，以濃度為橫坐標，吸收度為縱坐標，繪制標準曲線，進行回歸分析，方程為Y=36.555X+0.122 9，r=0.999 0。表明橙皮苷濃度在0.006 88～0.034 4 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度試驗 取橙皮苷對照品溶液6份，按擬定方法測定吸收度，結果6次吸收度相對標準偏差為1.7%，表明精密度良好。

2.2.5 穩定性試驗 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h測定其吸收度RSD 為1.1%，結果表明供試品溶液于室溫下在24 h內穩定性良好。

2.2.6 重復性試驗 取同批樣品6份，按擬定方法測定含量，其濃度分別為 7.62、7.84、7.98、7.78、7.96、8.01 mg/mL，RSD為1.9%，表明重復性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗 精密量取已知總黃酮含量的枳實樣品6份，分別精密加入橙皮苷對照品適量，按擬定方法測定，結果平均回收率為98.3%，RSD為2.1%，符合有關規定。

2.3 正交試驗及結果

2.3.1 正交試驗因素水平設計 以溫度(A)，時間(B)，加麩量(C)為考察因素，每個因素取3個水平以辛弗林含量，總黃酮含量為指標采用正交試驗對枳實的麩炒工藝進行優選。因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.3.2 試驗方法 將生藥切片置于煤氣爐上，將鐵鍋加熱至所需溫度，均勻撒入定量麥麩，即刻煙起，隨之投入凈枳實片，快速翻動，炒至枳實表面淡黃，麥麩色黑，取出，篩去麥麩，放涼［3］。

本試驗采用綜合評分法，將數次試驗中辛弗林含量最高的試驗數據定為100，其他各次與其相比記分;同法進行總黃酮評分。將兩個指標等比例加權計入綜合評分。由綜合評分確定所選指標的優劣。

2.3.3 數據處理及分析 有關試驗數據及其計算分析結果見表2、表3。

3.2 最佳工藝驗證試驗 稱取3份枳實樣品，以最佳工藝方法炒制，測定其辛弗林及總黃酮含量。結果見表4。

表2 麩炒枳實炮制正交試驗因素水平分析

表3 方差分析表

表4 驗證試驗

4 討論

4.1 從表2可知，對辛弗林及總黃酮含量影響因素大小依次為A>C>B，從表3方差分析結果表明，A具有顯著性影響，B，C無顯著性影響。結合各因素的K值(越大越好)可得出最佳組合是A2B3C1。通過對最佳工藝的驗證實驗證明了本工藝可行，即生品枳實投麩量100:5，于180℃，炒制1 min。

4.2 黃酮類化合物分子中具有無取代鄰二酚羥基時可與Al3+形成配合物，這些配合物可產生熒光或顏色加深，這些性質可用于黃酮類成分的定性、定量分析［4］。由于枳實內所含二氫黃酮類不具有鄰位無取代鄰二酚羥基，加入硝酸鋁試劑后不產生此類效應，無法以顯色法進行含量測定。考慮到枳實內所含黃酮類成分遠大于其他類成分的含量，試驗采用聚酰胺對黃酮類成分進行純化。經聚酰胺處理后除雜效果明顯，純化后的總黃酮樣品液可直接進行含量測定。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:172.

［2］朱祥枝，潘東明.四種枳實中藥材柚皮甙、橙皮甙和辛弗林含量的比較分析［J］.福建師范大學學報(自然科學版)，2005，21(1):91-93.

［3］賈天柱.中藥炮制學［M］.上海:上海科學技術出版社，2008:128-129.

［4］梁生旺.中藥制劑分析［M］.北京:中國中醫藥出版社，2005:127-129.