結核分枝桿菌Rv0341蛋白編碼基因iniB的多態性分析

吳園 胡頻頻 王易偉 李秀全 毛旭虎 鐘敏,4

(1.解放軍第二五四醫院檢驗科 天津 300142;2.第三軍醫大學醫學檢驗系臨床微生物及免疫學教研室暨重慶市生物制藥工程技術研究中心 重慶 400038;3.重慶市結核基因診斷中心實驗室 重慶 400020;4.重慶市公共衛生醫療救治中心 重慶 400036)

結核分枝桿菌存在一種特殊的生長狀態—依賴利福平(R)生長即依賴利福平結核分枝桿菌(依R菌)在適宜的R濃度下生長旺盛,無R生長不良或不能生長。依R菌感染所致肺結核患者具有病情重、耐多藥(74.4%～100%)、化療效果差和預后不良的臨床特征,比一般的耐藥病例危害更大。該類結核病如果再使用利福平,不但會導致化療失敗,而且可使病情惡化,是難治性結核病的產生和化療失敗的重要原因之一[1]。

在對依R菌的研究中發現：結核分枝桿菌假設蛋白Rv0341的高表達與依 R菌結核病密切相關,可視為依R菌的相關蛋白或標志物,可用于診斷依賴利福平結核分枝桿菌結核病(其蛋白2009年6月已獲得國家發明專利,專利號：200510057486.3)。

該研究擬通過對結核分枝桿菌假設蛋白Rv0341編碼基因iniB限制性片段長度的多態性分析,確認基因的保守性,為依R菌結核病臨床血清學快速診斷和試劑盒的研發奠定基礎,并探討依R菌在利福平培養管中Rv0341高表達的可能原因,為闡明依R菌的產生機制及依R菌結核病的有效防治提供幫助。

1 資料和方法

1.1 材料 依 R菌(14株)、耐 R菌(23株)、R敏感的結核分枝桿菌(12株)、結核分枝桿菌H37Rv、BCG及大腸埃希菌等滅活菌株,由重慶市結核基因診斷中心實驗室提供;LA-Taq with GC Buffer DNA聚合酶、限制性內切酶ApaⅠ、EcoRⅤ、KpnⅠ、SmaⅠ為 TAKARA公司產品;細菌基因組DNA基因組提取試劑盒(離心柱型)為天根生化科技(北京)有限公司產品;核酸回收試劑盒為OMEGA公司產品;DNA MakerⅦ、100 bp DNA Maker為北京天為時代科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌基因組DNA提取大腸埃希菌、51株結核分枝桿菌培養物經巴氏水浴1 h以上,無菌刮取培養物于高壓滅菌的EP管中,提取方法參照細菌基因組DNA提取試劑盒產品說明書。

1.2.2 iniB基因的擴增 用軟件Primer Premier 5.0設計引物(引物由上海生工合成)：上游引物5′-ATGACCTCGCT TATCGATTAC-3′;下 游 引 物5′-TCAGAACCCGGGTAGTCCGAAAA-3′。 PCR反應體系：LA-Taq with GC Buffer DNA聚合酶0.25 μ l,GC rich BufferⅠ 12.5 μ l,dNTP 4 μ l,上下游引物各 0.5 μ l,DNA 模板 4 μ l,雙蒸水 3.25 μ l。PCR反應條件如下：94℃預變性5 min;94℃50 s,55℃45 s,72℃1 min 30 s,30個循環;最后72℃延伸10 min。回收PCR產物中1440 bp大小的目的片段,操作參照核酸回收試劑盒說明書。

1.2.3 iniB基因的測序隨機抽取20個目的片段送上海英駿生物技術有限公司測序。

1.3 RFLP分析 對目的片段分別進行2組雙酶切：(1)ApaⅠ和EcoRⅤ雙酶切反應體系：PCR產物 4 μ l,Apa Ⅰ 0.5 μ l,10 ×L Buffer 1 μ l,補雙蒸水至10 μ l,37℃酶切 1 h,之后 65℃滅活 ApaⅠ20 min,在體系中繼續加入10×H Buffer 1μ l,EcoRⅤ 0.5μ l,補雙蒸水至20 μ l,37 ℃酶切1 h;(2)KpnⅠ和SmaⅠ雙酶切反應體系：PCR產物5μ l,限制性內切酶均為 0.7 μ l,10 ×T Buffer 1 μ l,BSA 1 μ l,補雙蒸水至10 μ l,37℃酶切1 h。酶切后1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其帶型。

2 結果

2.1 限制性內切酶對目的片段的酶切分析 ApaⅠ 、EcoRⅤ、KpnⅠ 、SmaⅠ在iniB 基因上的酶切位置見表1。目的片段經2組雙酶切均表現出相同的帶型,電泳圖譜見圖1、2,iniB基因在51株對利福平不同表型結核分枝桿菌中未發現多態性。

表1 iniB基因酶切片段

2.2 iniB基因測序結果 大腸埃希菌陰性對照無擴增產物,50株結核分枝桿菌及BCG經PCR得到長度為1440 bp的iniB基因,與預期大小相符。隨機抽取20個目的片段送上海英俊生物技術有限公司測序,包括依R菌9株,耐R菌6株,R敏感菌5株,測序結果18株與GeneBank公布的序列完全一致,1株R敏感菌在第703位發生堿基突變,由C突變為T,1株依R菌在第1 399位發生堿基突變,由G突變為A,氨基酸序列未發生突變。

3 討論

日本Nakamura等[2]報道了1例依R菌感染病例。自1999年全國耐藥結核病學術研討會上國內首次提出結核分枝桿菌依賴利福平的現象[3]以來,國內各地依 R結核桿菌發生率為7.3～17.1%[4-9]。按我國目前有活動性肺結核患者450萬計算[10],依R菌結核病患約有33～76萬。臨床依R菌肺結核患者具有病情重,耐多藥,病程延長,化療效果差和預后不良的臨床特征[11-13],這是結核病防治領域一個新的問題。

對依R菌在有R和無R 2種生長條件下的研究中發現[14-18]：依R菌的形態、結構、染色性、毒力和蛋白質表達等方面均有明顯差異。比較依R菌在有R和無 R兩種生長條件下的蛋白圖譜,發現84%的依R菌在含R管中結核分枝桿菌標準菌株H37Rv假設蛋白Rv0341表達量明顯增加;86%的非依R菌和H37Rv標準株在含R管和無R對照管均沒有Rv0341的高表達。提示：結核分枝桿菌假設蛋白Rv0341的高表達與依 R菌結核病密切相關[19]。

基于依R菌和非依R菌在蛋白Rv0341表達方面的差異,本試驗針對Rv0341編碼基因iniB進行了限制性片段長度多態性分析,發現其酶切后與結核標準菌株H37Rv、BCG的酶切圖譜相同,在依R菌、耐R菌及R敏感結核桿菌中不具有多態性,是相對保守的基因,測序結果也證實了不同表型結核桿菌的iniB無突變。

綜上分析提示：結核分枝桿菌在蛋白 Rv0341表達方面的差異可能是RNA轉錄差異或利福平誘導的結果。

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