喹硫平對小鼠腦缺血后膠質增生及IL-1β表達作用的實驗研究

房紹寬, 白 晶, 周春奎, 吳 江

急性缺血性卒中具有高發病率、高致殘率、高死亡率的特點,給社會家庭帶來了嚴重的經濟和精神負擔[1]。腦缺血的臨床表現不僅包括運動、感覺、視覺功能障礙,也包括遺忘、忽略等,而且常伴有情緒紊亂、抑郁焦慮及精神癥狀,這些均抑制腦缺血后生理和認知功能的恢復[2～7]。近幾年,很多證據表明一些非典型抗精神失常藥具有神經保護作用。本研究以小鼠腦缺血為模型研究非典型抗精神病藥喹硫平是否對腦缺血具有保護作用,從而為深入研究非典型抗精神病藥的神經保護作用的機制及對腦缺血的治療提供有意義的資料。目前關于腦缺血后神經保護的研究較多,但喹硫平對腦缺血后膠質細胞增生及 IL-1β表達水平的影響還不清楚。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性 ICR小鼠(Charles River,St Constant,QC,Canada)46只,實驗開始時重量 18～20克。我們選擇 ICR小鼠是因為它是一個非敏感體質的品系,而且經受頸總動脈閉塞后,存活率達到95%。小鼠在正常飲食、正常光照時間,室溫下飼養。

1.2 實驗動物分組(見表1)。

1.3 動物模型制備 用氯胺酮(110mg/kg)和甲苯噻嗪(15mg/kg)麻醉,麻醉后沿正中線切口,分離雙側總動脈并用棉線阻斷雙側頸總動脈血流60min,60min后撤掉棉線觀察血管血液復流,然后縫合正中線切口。假手術組執行相同程序,但不閉塞雙側的頸總動脈。手術后用熱毯維持小鼠在正常體溫。

1.4 給藥方法 喹硫平(由英國 Astra Zeneca制藥公司提供)溶于無菌生理鹽水中,根據先前的實驗[8,9],我們采用喹硫平 10mg/kg,缺血手術后給予小鼠喹硫平 10mg/kg或鹽水腹腔注射處理,1次/d,共 4w。

1.5 實驗方法 (1)免疫組織化學方法檢測GFAP和 CD11蛋白質表達：免疫組織化學方法采用SABC法,應用 SABC試劑盒,將組織切片置于 3%H2O2中常溫處理 10min,蒸鎦水洗滌 3次;加入血清封閉液 5min,加入一抗(兔抗 GFAP和 CD11特異性抗體)37℃ 1h,0.01mmol/L PBS洗滌 3次;加入生物素化二抗(羊抗兔 IgG)37℃ 10min,PBS洗 3次;加入 SABC試劑 37℃ 20min,PBS洗滌 4次;DAB顯色,蘇木素輕度復染,脫水封片鏡檢。(2)激光共聚焦顯微鏡檢測 GFAP-IL-1β共表達：將組織切片在二甲苯中浸 3次,正常山羊血清封閉,分別滴加 50μl的 1∶1混合的兔抗大鼠 GFAP(1∶100)和小鼠抗大鼠 IL-1β(1∶200),設空白對照(無一抗,加 PBS)和抗體特異性對照(加一抗不加二抗,加二抗不加一抗),所有切片同時染色。切片一抗加入后,置于濕盒內,4℃,過夜。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

表1 實驗動物分組

2 結 果

2.1 免疫組織化學染色結果 缺血組與假手術組相比較,腦缺血再灌后 2h GFAP免疫組化染色陽性細胞數量無明顯變化;缺血組與假手術組相比較,腦缺血再灌后 2d和 4d GFAP免疫組化染色陽性細胞數量增加(P＜0.05);藥物保護組與缺血組比較GFAP免疫組化染色陽性細胞數量無明顯變化;缺血組與假手術組相比較,腦缺血再灌后 8d、2w和 4w,GFAP免疫組化染色陽性細胞數量增加(P＜0.05);藥物保護組與缺血組比較 GFAP免疫組化染色陽性細胞數量明顯減少(P＜0.05)。CD11是活化的小膠質細胞表面標志,我們應用免疫組化的方法檢測腦缺血及給予喹硫平后海馬齒狀回內 CD11陽性細胞表達,借以分析海馬齒狀回內小膠質細胞活化情況及喹硫平對腦缺血后小膠質細胞活化的影響。缺血組與假手術組相比較,腦缺血再灌后 2h、2d和 4d,CD11免疫組化染色陽性細胞數量增加(P＜0.05);藥物保護組與缺血組比較各時間點 CD11免疫組化染色陽性細胞數量無明顯變化。

2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測結果 缺血組與假手術組相比較,腦缺血再灌后 4w,GFAP-IL-1β共表達陽性細胞(黃色)數量明顯增加(P＜0.01);藥物保護組與缺血組比較,GFAP-IL-1β共表達陽性細胞(黃色)數量明顯減少(P＜0.01)。

3 討 論

腦血管疾病是危害人類生命與健康的常見病和多發病,是人類 3大死亡原因之一,其中缺血性腦血管病占很大的比例。

腦缺血后反應性的膠質增生活化包括早期的小膠質細胞的活化和后繼的星型膠質細胞的活化。在正常生理情況下,小膠質細胞處于靜息狀態,分布于整個中樞神經系統內。當腦部受到損傷或有病原體入侵時,小膠質細胞遷徙到病變部位并發生一系列結構和功能的變化,發揮吞噬細胞的作用。星形膠質細胞在維持神經元正常活性方面發揮幾項重要作用,包括谷氨酸的攝取和釋放、鉀離子及氫離子的平衡緩沖以及水的轉運。但過度增生活化的膠質細胞可以釋放有害因子如腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素、干擾素[10]等導致遲發性神經元死亡(DND)。過度增殖的膠質細胞尤其是膠質疤痕的形成不僅可影響到神經元軸突的生長、突觸的重建及阻斷腦組織微循環[11],而且還是腦血管病后癲癇發病的根源,因此膠質細胞對神經元的作用具有利弊雙重性。抑制腦缺血后過度的膠質細胞增生及 IL-1β的表達成為腦缺血后神經功能重建目標的重要途徑之一。近幾年,很多證據表明一些非典型抗精神失常藥具有神經保護作用。基礎實驗證明非典型抗精神失常藥喹硫平可有效緩解 MPP+、H2O2及 β淀粉樣肽等由于氧化應激所誘導的 PC12細胞死亡[12,13]。這些神經保護作用的機制包括影響 Bax/Bcl-xl的轉位和表達或 SOD-1的上調[14～16]。先前的動物實驗結果表明喹硫平能有效緩解慢性應激所導致的海馬 BDNF和細胞增生的縮減[17,18],而且喹硫平能有效緩解安非他明所誘導的行為學改變和對多巴胺神經末梢的毒性作用[19]。喹硫平在改善腦缺血后精神癥狀同時也能夠減輕腦缺血后認知功能的損傷[20]。

我們在前期的研究中發現CCAO(common carotid artery occlusion,頸總動脈閉塞)能阻斷 85%的腦血流并足以誘導小鼠神經元損傷而且死亡率僅有 5%。經過我們對 30、60、90min CCAO模型的初步研究,發現 60min CCAO在小鼠模型中產生明顯的急性神經變性和記憶損傷[21,22]。因此本研究中,我們采用了60min CCAO模型。GFAP(Glial fibrillary acidic protein,膠質纖維酸性蛋白)是星形膠質細胞中絲蛋白的主要組成部分,其表達量的增加通常被作為星形膠質細胞在中樞神經系統(CNS)損傷后活化和增殖的標志。我們應用免疫組化的方法檢測腦缺血及給予喹硫平后海馬齒狀回內 GFAP陽性細胞表達,借以分析腦缺血后海馬齒狀回內星形膠質細胞增殖情況及喹硫平對腦缺血后星形膠質細胞增殖的影響。采用激光共聚焦顯微鏡觀察方法評價腦缺血后的炎癥反應及喹硫平對腦缺血后炎癥反應的作用。

本研究顯示腦缺血再灌后 2d、4d、8d、2w和 4w時 GFAP免疫組化染色陽性細胞數量增加,腦缺血再灌后 8d、2w和 4w時喹硫平減少 GFAP陽性細胞數量,抑制星形膠質細胞增殖;腦缺血再灌后 2h、2d和 4d時 CD11免疫組化染色陽性細胞數量增加,喹硫平對 CD11的表達沒有影響。缺血再灌后 4w時GFAP-IL-1β共表達增加,而喹硫平減少 GFAP-IL-1β的共表達。本研究結果提示我們非典型抗精神失常藥物喹硫平能夠減輕腦缺血后星形膠質細胞的過度增生和活化,同時降低 IL-1β的表達水平為治療缺血性腦損傷所伴發的精神紊亂提供新途徑。

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