多奈哌齊對血管性癡呆大鼠海馬 CA1區 NF-κB及COX-2表達的影響

石秋艷, 張 琪, 孫 鵬, 孫惠芳, 卓金士, 張國志

慢性腦缺血是血管性癡呆(vascular dementia,VD)的病理基礎,其病理生理機制尚未完全明了,但炎癥在其發病過程中起著十分重要的作用已達成共識。免疫炎性損傷是 VD的主要病理生理改變之一 ,核因子-κB(nuclear factor-κb,NF-κB)及環氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)均參與腦缺血后炎癥反應。多奈哌齊為六氫吡啶衍生物,作為治療 AD的經典藥物,已有許多應用其治療 VD的臨床試驗,并證實其對 VD的改善作用,但對其機制尚缺乏了解。VD作為唯一可防治的癡呆,探索其發病的相關因素和發病機制,尋求有效治療辦法,具有重要的社會和醫學意義。

本實驗采用雙側頸總動脈結扎制備 VD模型,觀察鼠腦模型海馬 CA1區組織形態學改變及多奈哌齊對 VD大鼠行為學改變及 NF-κB、COX-2表達的影響,探討多奈哌齊對 VD腦保護作用的可能機制,為進一步指導臨床治療提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性 SD大鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)120只,體重(250±30)g;Morris水迷宮(華北煤炭醫學院提供);多奈哌齊(安理申)5mg×7×2,衛材(中國)藥業有限公司制造,批號：080414A;兔抗鼠 COX-2抗體、兔抗鼠NF-κBp65抗體、羊抗兔 IgG、DAB顯色劑、PBS緩沖液(北京中杉金橋生物技術有限公司)、TUNEL試劑盒(羅氏公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 按參考文獻[1,2]制備血管性癡呆模型：大鼠術前禁食 12h,禁水 4h,用 3.5%的水合氯醛(1ml/100g)將大鼠腹腔麻醉,保證手術操作期間大鼠有自主呼吸。仰臥位固定,去頸正中部毛,碘酒消毒后行頸正中切口,分離肌肉、頸總動脈,模型組大鼠用 5號絲線雙重結扎雙側頸總動脈,假手術組大鼠僅分離雙側頸總動脈。依次縫合頸部肌肉和皮膚,涂上慶大霉素,動態觀察其行為變化。假手術組除不結扎雙側頸總動脈外,其余處理與手術組相同。所有大鼠在相同條件下飼養,可自由得到食物和水。

1.2.2 動物分組及處理 120只 SD大鼠隨機分為假手術組(S組)、模型組(M)、多奈哌齊治療組(D),每組選取造模 4w、8w作為觀察點(造模成功后大鼠平均生存時間為 16w)。每個時間點 20只大鼠,將多奈哌齊用生理鹽水稀釋成 1mg/m l,治療組于造模成功后第 2天予以多奈哌齊 1mg/kg/d灌胃,假手術組與模型組組予以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 行為學觀察-Morris水迷宮法 水迷宮水深 62cm,水溫 25℃,在固定象限設有安全島,高度 60cm,液面高于安全島 2cm。各組大鼠進行定位航行實驗,測定其逃避潛伏時間作為學習記憶能力的指標,記錄大鼠術前、術后不同時間的檢測結果。比較各組潛伏期,評價大鼠學習記憶功能。

1.2.4 腦組織取材和組織切片制備 各組于相應時間點麻醉動物,以生理鹽水和 4%多聚甲醛灌注固定后斷頭取腦,從視交叉吻合端至尾端冠狀連續切片,片厚 3mm。修塊后置于 4%多聚甲醛液中固定 24h以上。常規梯度酒精脫水、透明、浸蠟包埋,做 5μm切片分別行 HE染色 、NF-κBp65和 COX-2免疫組化染色。

1.2.5 免疫組化染色檢測 NF-κB、COX-2：(1)切片常規脫蠟至水;(2)3%H2O2室溫 20min滅活內源性酶;(3)微波或高壓修復抗原;(4)滴加封閉液 30min;(5)滴加兔抗鼠 COX-2抗體(1∶100)或兔抗鼠 NF-κBp65抗體(1∶100),4℃過夜;(6)復溫后滴加生物素化羊抗兔 IgG 37℃ 1h;(7)滴加鏈霉素抗生物素過氧化物酶溶液,37℃ 30m in;(8)DAB顯色;(9)蘇木素復染 2～3min,分化后充分藍化,脫水透明封片。除滴加封閉液步驟不洗外,各步驟之間用 PBS緩沖液洗 5m in×3次。用 PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.2.6 結果判定及計數 取各大鼠斷面水平相似的連續腦組織切片,每只大鼠隨機選取一張切片,在高倍物鏡下進行觀察。COX-2以胞膜或胞漿出現棕黃色深染視為陽性細胞;NF-κB陽性表達為胞漿或胞核出現棕黃色深染,每張切片計數 5個不同 400倍視野下陽性細胞數,取其平均數。

2 結 果

2.1 大鼠行為學觀察結果 各組大鼠術前篩查的平均逃避潛伏期無統計學差異(P＞0.05)。術后進行定位航行的成績比較：與模型組相比,其它組大鼠學習和記憶逃避潛伏期均明顯縮短(P＜0.01);藥物治療組與假手術組之間比較無明顯統計學意義,兩組間比較,模型組 1個月較 2個月成績略優(P＜0.05)。結果表明,與假手術組比較,模型組大鼠行為模式發生了改變,藥物治療組大鼠行為模式接近與假手術組(見表1)。

2.2 HE染色觀察 光鏡下正常組和假手術組大鼠海馬 CA1區錐體細胞 3～4層,排列緊密、整齊,細胞形態正常,胞體完整,界線清晰,無變性壞死,胞核大而圓,胞質豐富。模型組大鼠海馬 CA1區錐體細胞丟失明顯,細胞 1～2層排列紊亂、松散,錐體細胞固縮,界線不清,可見大量變性壞死細胞,核固縮或核碎裂呈深藍色,胞漿濃縮,現深紅色鬼影細胞及神經細胞被吞噬現象。

2.3 NF-κBp65、COX-2 表達的 變化 NF-κBp65、COX-2陽性反應主要表現為胞漿或胞核的棕黃色深染,光鏡下觀察可見海馬 CA1內的 NF-κBp65、COX-2陽性細胞表達,胞漿或胞核內均見表達,呈棕黃色。假手術組表達較少,染色較淺,模型組及藥物治療組表達較多,染色深(見表2)。免疫組織化學染色法同時相觀察,模型組 NF-κBp65、COX-2陽性細胞計數高于假手術組(P＜0.01),經多奈哌齊治療后 NF-κBp65、COX-2陽性細胞計數與模型組相比明顯減少(P＜0.01)。

表1 各組大鼠水迷宮實驗的學習和記憶成績比較(±s,t/s)

表1 各組大鼠水迷宮實驗的學習和記憶成績比較(±s,t/s)

各組不同時間點均 20只大鼠,與假手術組比較*P＜0.01;與模型組比較△P＜0.01;模型組兩組間比較▽P＜0.05

組別學習潛伏時間(t/s)4w 8w記憶潛伏時間(t/s)4w 8w假手術組模型組治療組21.5±3.22 59.1±8.45*▽22.73±4.52*△22.3±2.85 67.05±10.30*▽24.05±3.17*△19.80±4.99 53.07±17.40*▽20.31±4.62*△17.69±4.22 60.67±17.61*▽19.27±4.95*△

表2 各組大鼠 CA1區 NF-κBp65、COX-2陽性細胞計數比較(±s,個數 /視野)

表2 各組大鼠 CA1區 NF-κBp65、COX-2陽性細胞計數比較(±s,個數 /視野)

各組不同時間點均 20只大鼠,與假手術組比較*P＜0.01;與模型組比較△P＜0.01

組別NF-κBp65(個數 /視野 )4w 8w COX-2(個數 /視野)4w 8w假手術組模型組治療組0.45±0.82 15.55±3.02*7.70±2.66*0.60±0.25 16.10±2.97*8.40±2.06*△0.35±0.67 20.75±1.88*10.15±0.76*△0.45±0.60 21.40±3.41*10.20±1.43*△

3 討 論

血管性癡呆(VD)是指由各種腦血管疾病引起的持續性腦功能障礙而產生的一種獲得性智能損害綜合征,包括缺血性腦卒中、出血性腦卒中以及急或慢性缺氧腦血管病變引起的癡呆。亞致死性腦缺血導致易損神經元的損害是造成 VD的重要原因,尤其是對海馬的損傷更易造成學習記憶能力下降,甚而發展為癡呆。然而血管性癡呆的發生是一個多因素的過程,其病因較為復雜,其確切發病機制尚不明確,到目前無論是動物模型研究還是臨床試驗均支持炎性反應參與缺血性腦損傷。

慢性腦缺血誘發行為學障礙是目前研究血管性癡呆最常用也是最經典的模型。大鼠雙側頸總動脈結扎后有 15個腦區的局部腦血流量降低 25% ～87%,因此本實驗應用大鼠雙側頸總動脈永久性結扎制作慢性低灌注模型。雙側頸總動脈結扎可引起反映大鼠行為學的各項指標顯著下降,并隨著時間的推移,大鼠的學習記憶能力有進一步的降低,本實驗發現,行為學檢測模型組 1個月較 2個月成績略優(P＜0.05),表明在慢性低灌注狀態下,缺血缺氧狀態對學習記憶功能的影響是持續的、漸進的。這與 Nanri及 Pappas等[3,4]雙側頸總動脈結扎后可導致腦組織的漸進性損害,使學習記憶損害程度進行性加重的研究結果相符。

近年來大量實驗表明：VD大鼠 CA1區 NF-κB和 COX-2陽性細胞數均明顯升高。大鼠慢性腦缺血可能刺激海馬 CA1區的錐細胞活化核因子-κB進入細胞核內。而 COX-2啟動子上含有 2個 NF-κB位點序列：(5'-GGACTTTCC-3'),分別位于-2445/-2427和-2223/-2214。NF-κB活化可促進 COX-2基因的轉錄,對其表達起著正向調節作用。另 Lim[5]等發現 NF-κB5亞基的反義寡脫氧核苷酸能抑制NF-κB的活性和 COX-2的表達,均顯示 NF-κB與COX-2的表達相互促進,共同參與血管性癡呆的神經損傷。對兩者的研究可能成為治療血管性癡呆的靶點之一。

NF-κB是一種重要的核轉錄因子,廣泛存在于真核細胞中,參與多種基因表達的調控,而這些基因都是與免疫應答反應相關的,如環氧化酶-2,通過調節細胞因子和炎癥介質表達參與許多疾病的病理生理過程。現已證實腦缺血損傷可使 NF-κB激活[6]。研究表明,當中樞神經系統缺血時,存在于腦血管內皮細胞、神經元及神經膠質細胞中的 NF-κB可被特異性激活,與腦缺血損傷的炎癥機制密切相關。本實驗發現：假手術組未見明顯 NF-κB表達,而模型組可見 NF-κB表達顯著增高,差異具有統計學意義(P＜0.01),這與前人研究結果類似。NF-κB被認為是腦缺血后炎癥反應的始動因素,體內外研究的表明NF-κB在腦缺血后的神經損傷中起關鍵作用[7],它通過調節細胞因子和炎癥介質表達,如炎癥酶 COX-2,引發炎癥級聯反應,加速細胞凋亡,直接或間接地參與腦缺血損傷過程。腦缺血后發生的 NF-κB活化引發的一系列病理生理機制是血管性癡呆腦損傷的重要環節。

COX-2為誘導型環氧化酶,是前列腺素合成過程中一個重要限速酶。其合成受多種致病因子調節,主要在白細胞和腦中表達。研究表明：誘導型環氧化酶 COX-2在神經系統炎癥中起著重要作用[8],是炎癥反應介導的細胞毒性的決定因素之一[9],對神經系統損傷起調控作用。近年來研究發現[10,11]：在血管性癡呆大鼠海馬 CA1區 COX-2陽性細胞數量明顯升高,COX-2蛋白及其反應產物的表達明顯增強。本實驗發現：假手術組未見明顯 COX-2表達,而模型組 COX-2陽性細胞數明顯增多,差異具有統計學意義(P＜0.01)。這與 Masaki等[12]發現缺血后 CA1區海馬神經元死亡前 COX-2mRNA和蛋白質表達均升高的研究結果符合。應用 COX-2選擇性抑制 SC58125后,大鼠 CA1區神經元在全腦缺血后存活率增高,這些結果提示 COX-2活化參與全腦缺血后 CA1區神經元死亡。它可能通過：(1)炎癥反應和自由基損傷;(2)組織低灌流;(3)興奮性毒性的神經細胞死亡和細胞內鈣超載導致腦損傷,參與腦缺血后的組織損傷和認知能力障礙,從而參與血管性癡呆的病理生理機制。

目前膽堿酯酶抑制劑與興奮性氨基酸受體拮抗劑(NMDA拮抗劑)被認為是最具有前景的治療 VD的藥物。多奈哌齊作為一種新型的可逆的膽堿酯酶抑制劑,除了具有抑制膽堿酯酶的作用外,還具有改善腦血流[13]、保護海馬神經元[14]、減輕自由基導致的神經變性等作用。已有多個應用多奈哌齊治療VD的臨床試驗,這些試驗的結論證實,與安慰劑相比,多奈哌齊治療的患者認知功能等均有明顯的改善,且耐受性良好。本實驗發現：行為學上,經多奈哌齊治療后大鼠學習和記憶潛伏期均較模型組明顯縮短(P＜0.01),能夠改善 VD大鼠的記憶、學習和行為能力;海馬 CA1區 NF-κB和 COX-2陽性細胞數上,兩者在 VD大鼠腦組織中的表達均較假手術組顯著增高,但多奈哌齊治療組中兩者的表達較模型組明顯降低,具有統計學意義(P＜0.01),表明多奈哌齊對 VD大鼠腦組織中 NF-κB和 COX-2的表達有一定抑制作用。可能通過阻止細胞內鈣超載、抑制一些興奮性氨基酸受體的激活、防止細胞的進一步去極化、提高組織的灌流量等來阻止 NF-κB的激活及進一步減少炎癥級聯反應中相關因子如 COX-2的表達,達到抑制 VD大鼠腦組織中的炎癥反應,使缺血區神經元存活率增高,起到腦保護的作用。

綜上所述,多奈哌齊能改善 VD大鼠記憶、學習和行為能力,通過下調 VD大鼠 CA1區 NF-κB和COX-2的表達抑制腦內炎癥反應。多奈哌齊的這一抑制 VD病理機制靶點的作用有望為 VD的臨床治療提供實驗依據。由于本組實驗觀察時間點少,觀察時間短,多奈哌齊上述作用的確切信號轉導途徑還有待進一步研究。

[1]TayebatiSK.Animalmodels of cognitive dysfunction[J].Mech Ageing Dev,2006,127(2)：100-108.

[2]SartiC,Pantoni L,Bartolini L,etal.Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion：what can be learned from experimentalmodels[J].Neurol Sci,2002,2：203-204.

[3]Nanri M,Watanabe H.Availability of 2VO rats as amodel for chronic cerebrovascular disease[J].Nanri Yr,1999,113(2)：85-95.

[4]Pappas BA,de la Torre JC,Davidson CM,etal.Chronic reduction of cerebral blood flow in the adult rat：late-emerging CA 1 cell loss and memory dysfunction[J].Brain Res,1996,708(1-2)：50-58.

[5]Lim JW,Kim H,Kim KH.Nuclear factor-kappa B regulates cyclooxcygenase-2 expression and cellproliferation in human gastric cancer cells[J].Lab Invest,2001,81(3)：349-360.

[6]Pradillo JM,Romera C,Hurtado O,etal.TNFR1 upregulation mediates tolerance after brain ischemic preconditioning[J].JCereb Blood Flow Metab,2005,25(2)：193-203.

[7]ZhangW,Potrovita I,Tarabin V,etal.Neuronal activation of NF-kappa B contributes to cell death in cerebral ischem ia[J].JCereb Blood Flow Metab,2005,25(1)：30-40.

[8]Tzeng SF,Hsiao HY,Mak OT.Prostaglandins and cyclooxygenases in glial cells during brain inflammation[J].Curr Drug Targets Inflamm Allergy,2005,4(3)：335-340.

[9]Gu WZ,Brandwein SR.Inhibition of type IIcollagen-induced arthritis in ratsby triptolide[J].Int J Immunopharmacol,1998,20(8)：389-400.

[10]蔡志友,宴 勇,張 駿,等.依達拉奉抑制血管性癡呆大鼠腦組織環氧化酶-2與 NF-kB的表達[J].中國老年學雜志,2009,29(9)：1074-1077.

[11]翟鍇華,盧 宏,騰軍放,等.血管性癡呆大鼠海馬區核因子-kB、環氧化酶-2的表達變化[J].中國實用神經病學雜志,2007,10(3)：88-89.

[12]Masaki N,Koichi U,Raymond LZ,etal.Cyclooxygnase-2 inhibition prevents delayed death of CA1hippocampal neurons following global ischem ia[J].Proc Natl Acad Sci,1998,95(18)：10954-10959.

[13]Staff RT,Gemmell HG,Shanks MF,etal.Changes in the rCBF images of patients with Alzheimer's disease receiving Donepezil therapy[J].Nucl Med Commun,2000,21(1)：37-41.

[14]蔡大勇,趙 雁,黃啟福.鹽酸多奈哌齊對 D-半乳糖致原代培養神經元損傷的保護作用及其機制[J].中國藥師,2002,5(11)：647-650.