頭孢曲松鈉對(duì)谷氨酸作用后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

劉春華, 王維治

頭孢曲松鈉在臨床上一直作為一種有效的抗生素被廣泛應(yīng)用。但近期有研究表明,在戊四唑點(diǎn)燃的小鼠癲癇模型中[1],在應(yīng)用戊四唑前 6d每天注射頭孢曲松鈉(200mg/kg),可以顯著減輕戊四唑誘發(fā)的癲癇發(fā)作,減少死亡率。在轉(zhuǎn)基因小鼠肌萎縮側(cè)索硬化模型中[2],長(zhǎng)期應(yīng)用頭孢曲松鈉可以保留小鼠前爪握力,延緩小鼠病程和體重減輕等癥狀發(fā)生,生存期延長(zhǎng) 10d,提示頭孢曲松鈉可能具有神經(jīng)保護(hù)作用。故本試驗(yàn)著重研究頭孢曲松鈉對(duì)谷氨酸作用后神經(jīng)細(xì)胞活性、谷氨酸攝取能力、以及細(xì)胞內(nèi)鈣超載反應(yīng)的影響,以期發(fā)掘這種臨床已長(zhǎng)期安全應(yīng)用其藥物尚未人知的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 頭孢曲松鈉為上海新先鋒藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字 H31020945,產(chǎn)品批號(hào) 051135;L-谷氨酸 (分子量為 147.13)為Sigma公司產(chǎn)品;DMEM高糖培養(yǎng)基為 Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品;噻唑蘭(thiazoylblue tetrazolium bromide,MTT)為 Sigma公司產(chǎn)品;L-[3H]-谷氨酸為英國(guó) Amersham公司提供;Fluo-3/AM由日本同仁化學(xué)研究所提供;二氫紅藻氨酸(dihydrokainic acid,DHK)由 Tocris公司提供;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)酶聯(lián)免疫試劑盒由 Promega公司提供;白細(xì)胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供;其余試劑均為市售分析純。美國(guó) Forma Scientific二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱;百萬級(jí)無菌細(xì)胞培養(yǎng)間由哈醫(yī)大附屬二院實(shí)驗(yàn)中心提供;日本 Olympus IX70倒置顯微鏡;德國(guó) ZEISS公司生產(chǎn)LSM-510-META型激光共聚焦掃描顯微鏡(laser scanning confocalmicroscope,LSCM)。

1.2 大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞混合培養(yǎng) 根據(jù)Guillet B[3]等的方法并加以改良。無菌分離出生48h內(nèi) Wistar乳鼠大腦皮層,PBS液沖洗 2次;0.25%胰蛋白酶中剪碎后,37℃消化 3m in,中間輕輕振搖 2～3次。吸棄表面的胰蛋白酶,加入倍量含10%胎牛血清的 DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化,1000rpm離心 3m in。吸棄上清液,加入培養(yǎng)液制成密度約 104的單細(xì)胞懸液,接種于涂有多聚賴氨酸的 96孔板中,置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),48h全量換液,此后每周兩次半量換液。倒置顯微鏡定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化,培養(yǎng) 8d待細(xì)胞成熟后用于模型制作。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組：細(xì)胞正常培養(yǎng) 11d;頭孢曲松鈉組：細(xì)胞培養(yǎng) 8d時(shí)加入含頭孢曲松鈉培養(yǎng)液(終濃度 1mol/L)培養(yǎng) 2d,PBS沖洗后正常培養(yǎng) 24h。

1.4 MTT比色法檢測(cè)有/無谷氨酸損傷時(shí)細(xì)胞活性 以 104密度在 96孔板培養(yǎng)細(xì)胞(每組 7孔),在培養(yǎng) 10d時(shí)應(yīng)用或不應(yīng)用谷氨酸損傷(終濃度為 50μmol/L含 L-谷氨酸培養(yǎng)液培養(yǎng) 15min,PBS沖洗后換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng) 24h)。每孔加入 5%MTT 20μl,37℃培養(yǎng) 6h后換 100μl二甲基亞砜溶解震蕩 5min,酶標(biāo)儀(波長(zhǎng) 492nm)測(cè)各孔吸光度值,后者可反映細(xì)胞數(shù)量及活性。

1.5 L-[3H]-谷氨酸重?cái)z取的測(cè)定 96孔板各組細(xì)胞(每組 5孔)每孔加入 L-[3H]-谷氨酸 317×107Bq/L,37℃孵育 10min,棄去液體,用 Hanks液洗滌 3遍,棄去洗滌液,每孔加入 0.5mol/L NaOH 1ml將細(xì)胞裂解,取 0.1ml消化液,加入 3ml閃爍液,放置6h后測(cè)定閃爍記數(shù)。攝取率換算成fmol/min。

1.6 LSCM測(cè)定細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度變化 避光條件下,96孔板各孔細(xì)胞(每組 5孔)PBS沖洗后,加入含有 Fluo-3/AM(終濃度 4mol/L)和 Pluronic-F127(終濃度 0.05%)的無血清的 DMEM培養(yǎng)液(每孔 100l),37℃孵育 4min。不含熒光探針 PBS液充分沖洗后加入含鈣 PBS中(含 13mmol/L NaCl、2.68mmol/L KCl、8.09mmol/L Na2HPO4、1.46mmol/LKH2PO4及 0.9mmol/L CaCl2,pH值為7.4),室溫穩(wěn)定 20min。在 LSCM下向細(xì)胞加入 50mol/L谷氨酸作用 2min引起細(xì)胞短暫內(nèi)鈣超載中,在應(yīng)用谷氨酸前 30s加或不加 DHK 100μmol/L。LSCM同一視野連續(xù)動(dòng)態(tài)掃描,實(shí)時(shí)觀測(cè)各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化情況。488nm氬激光激發(fā) Fluo-3/AM發(fā)出綠色熒光,當(dāng) Ca2+濃度在 10～1000nmol/L時(shí)熒光強(qiáng)度與Ca2+濃度的對(duì)數(shù)呈線數(shù)關(guān)系。熒光強(qiáng)度改變用不同顏色表示。

1.7 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,分別應(yīng)用 BDNF、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒,按試劑盒說明書操作,用酶標(biāo)儀在 450nm處測(cè)定各孔吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng) BDNF、IL-6含量。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征及改變接種細(xì)胞 24h后貼壁,少部分長(zhǎng)出突起,膠質(zhì)細(xì)胞開始鋪展。3d時(shí),神經(jīng)元形態(tài)漸典型,突起間串聯(lián)成簡(jiǎn)單環(huán)狀網(wǎng)絡(luò),突起周圍常見膠質(zhì)細(xì)胞存在,逐漸形成膠質(zhì)細(xì)胞層。6d時(shí),神經(jīng)膠質(zhì)鋪滿整個(gè)底層,神經(jīng)元位于其上,胞體飽滿、邊界清晰、折光性強(qiáng)。8d時(shí),神經(jīng)元突起明顯,胞體大,呈錐形,形成明顯神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。頭孢曲松鈉組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組比較無差別。

2.2 MTT法測(cè)定有/無谷氨酸損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞活性 與對(duì)照組比較,無谷氨酸損傷時(shí)頭孢曲松鈉組吸光度值降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;有谷氨酸損傷后其吸光度值明顯升高(見表1)。

2.3 L-[3H]-谷氨酸重?cái)z取的測(cè)定 頭孢曲松鈉組較對(duì)照組對(duì)谷氨酸的攝取率明顯增加(見表1),提示頭孢曲松鈉可以提高神經(jīng)細(xì)胞的谷氨酸攝取能力。

2.4 LSCM測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化 靜息狀態(tài)下,對(duì)照組(141.3±6.2)與頭孢曲松鈉組(127.3±12.1)細(xì)胞內(nèi) Ca2+熒光強(qiáng)度的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。加入谷氨酸短暫作用后,對(duì)照組由 141.3±6.2上升到 194.5±5.9,15min左右恢復(fù)至靜息狀態(tài),頭孢曲松鈉組 Ca2+熒光強(qiáng)度由 127.3±12.1上升到170.9±3.4,10min內(nèi)恢復(fù)至靜息狀態(tài),故頭孢曲松鈉組較對(duì)照組 Ca2+熒光強(qiáng)度上升緩慢但恢復(fù)迅速;加入 GLT1拮抗劑 DHK后,兩組 Ca2+熒光強(qiáng)度變化基本相同,即明顯大幅度上升后無明顯下降。

2.5 上清液中 BDNF、IL-6水平 頭孢曲松鈉組較對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 BDNF含量明顯增加,而兩組 IL-6含量的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

表1 各組有/無谷氨酸損傷時(shí)細(xì)胞活力、谷氨酸攝取率以及上清液中 BDNF、IL-6含量比較(±s)(n=7)

表1 各組有/無谷氨酸損傷時(shí)細(xì)胞活力、谷氨酸攝取率以及上清液中 BDNF、IL-6含量比較(±s)(n=7)

與對(duì)照組比較*P＜0.01,△P＞0.05

對(duì)照組頭孢曲松鈉組0.813±0.023 0.795±0.010△0.624±0.028 0.738±0.021*213.1±6.5 277.1±10.7*153.1±3.5 237.1±4.7*25.3±1.2 27.3±2.1△

3 討 論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一,但其在細(xì)胞外濃度過高就會(huì)產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性,導(dǎo)致鈣離子通道的開放、神經(jīng)元腫脹變性等一系列有害的生化過程,參與了諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病過程。因此谷氨酸的攝取和清除對(duì)于維持正常生理狀態(tài)以及阻斷諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展都具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)研究表明,經(jīng)頭孢曲松鈉預(yù)處理的神經(jīng)細(xì)胞,在遭受谷氨酸損傷時(shí)細(xì)胞存活數(shù)量和活性提高,在加入谷氨酸后其重?cái)z取谷氨酸能力增強(qiáng),提示頭孢曲松鈉有助于降低細(xì)胞外谷氨酸濃度,從而減輕谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性的損害,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的破壞以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載是谷氨酸興奮性神經(jīng)毒性損害過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究頭孢曲松鈉對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,靜息狀態(tài)下頭孢曲松鈉預(yù)處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度無影響,但加入谷氨酸短暫作用誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載狀態(tài)下,頭孢曲松鈉能有效地拮抗谷氨酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用。

關(guān)于頭孢曲松鈉減輕谷氨酸神經(jīng)損傷的具體機(jī)制目前不清。最新研究發(fā)現(xiàn),頭孢曲松鈉能上調(diào)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體中谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 1(GLT-1)的表達(dá)。在亨廷頓的 R6/2小鼠模型中[4],腹腔注射頭孢曲松鈉(200mg/kg)5d后,免疫斑點(diǎn)檢測(cè)可見腦皮層和紋狀體中 GLT-1蛋白表達(dá)明顯增加,且模型中存在的紋狀體谷氨酸攝取缺陷被糾正。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在終止谷氨酸能突觸傳遞中起重要作用,由于谷氨酸沒有酶解滅活機(jī)制,只能通過谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體重?cái)z取后參與谷氨酸-谷氨酰胺循環(huán),從而消除其與相應(yīng)谷氨酸受體的結(jié)合。GLT-1可能是目前人類已知的最重要谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[5],其在前腦向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的谷氨酸占全部谷氨酸攝取的 90%。所以,可以推測(cè)頭孢曲松鈉可能是由于促進(jìn)了 GLT-1的表達(dá),使胞外多余谷氨酸更多地被轉(zhuǎn)運(yùn)清除,從而降低了胞外谷氨酸濃度以及繼發(fā)的細(xì)胞內(nèi)鈣超載作用。本研究進(jìn)一步應(yīng)用 LSCM觀察到,正常情況下頭孢曲松鈉能有效拮抗谷氨酸引起的短暫內(nèi)鈣超載作用,而事先加入GLT1高度特異敏感性抑制劑 DHK后,頭孢曲松鈉組與正常組細(xì)胞內(nèi) Ca2+熒光強(qiáng)度變化曲線大致相同,頭孢曲松鈉的上述拮抗作用消失。這進(jìn)一步證實(shí)了前述的推斷,即頭孢曲松鈉對(duì)神經(jīng)細(xì)胞谷氨酸重?cái)z取增強(qiáng)效應(yīng)是通過調(diào)節(jié) GLT1來實(shí)現(xiàn)的。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn),除了具有減輕谷氨酸損傷作用之外,頭孢曲松鈉還能增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 BDNF的含量,故其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制還可能為通過 BDNF的抗細(xì)胞凋亡作用來增加神經(jīng)細(xì)胞的存活數(shù)量。頭孢曲松鈉不能引起炎癥因子 IL-6的濃度變化,提示頭孢曲松鈉的神經(jīng)保護(hù)作用中可能不包括抗炎、抗菌機(jī)制。

綜上所述,頭孢曲松鈉可能通過多種機(jī)制來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,深入發(fā)掘頭孢曲松鈉的這種潛在治療作用,在理論和實(shí)際應(yīng)用方面都具有重要意義。

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