澤瀉水提物對正常大鼠利尿活性及腎臟髓質(zhì)AQP2作用研究

伍小燕,陳 朝,張國偉

(1.廣西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院藥劑科,廣西南寧,530023;2.河北大學中醫(yī)系,河北保定,071000)

澤瀉(Rhizoma Alismastis)為澤瀉科植物澤瀉 Alisma orientalis(Sam)Juzep的干燥塊莖,具利小便、清濕熱的功效,主治小便不利、水腫漲滿、泄?jié)赡蛏佟崃軡础⑻碉嬔灐⒏哐取Ｄ壳皾蔀a利尿機制尚未完全闡明[1],本實驗對澤瀉利尿機制做了以下初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器:代謝籠,蘇州馮氏實驗動物設備有限公司;生化儀,日立 7180型全自動生化儀;PCR儀,ABI 7 50 0 Real Time PCRSystem;BIO-RAD Gel Dox XR凝膠成相系統(tǒng)。

1.1.2 動物:雄性SD大鼠,來自于廣東醫(yī)學實驗動物中心,動物使用前于實驗環(huán)境中適應3 d,動物飼養(yǎng)環(huán)境,溫度為(23±2)℃,濕度為(55±5)%,12 h/12 h白晝交替,自由飲水,標準飼養(yǎng)飼料。

1.1.3 試藥:澤瀉顆粒(澤瀉水提物,江陰天江藥業(yè)有限公司,每克相當于10 g生藥,用前按劑量溶于生理鹽水);呋塞米(上海復星朝暉藥業(yè)有限公司);TIANScript cDNA Synthesis Kit、Real-MasterMix、SYBR GreenⅠ(北京 TIANGEN 公司)。

1.2 方法

1.2.1 合格實驗大鼠篩選及分組:雄性SD大鼠50只,體重180～200 g,預先置于代謝籠中適應環(huán)境12 h,按4%體重灌胃給予生理鹽水后立即被放入代謝籠中(1只/籠),收集6 h尿液,測量尿量、尿 Na+、尿 K+,尿Cl-,計算出各指標的正常值范圍( x±1.96 s),選擇以上4個指標均在正常范圍內(nèi)的大鼠30只,分為5組,即生理鹽水組,呋塞米組,澤瀉100 mg/kg組,澤瀉500 mg/kg組,澤瀉1 000 mg/kg組,每組6只。

1.2.2 澤瀉利尿?qū)嶒?合格實驗大鼠,實驗前每只動物置于獨立代謝籠中預適應24 h,禁水不禁食,第2天給供試藥品,分別經(jīng)口給予生理鹽水,呋塞米10 mg/kg,澤瀉100 mg/kg,澤瀉 500 mg/kg,澤瀉1 000 mg/kg,劑量為1 mL/100 g。給藥前按大鼠體重給予2.5 mL/100 g的生理鹽水負荷,30 min后給藥。給藥8次,每天1次,收集第1次和第8次給藥后24 h尿液,記錄第1次給藥后1、6、24 h及8次給藥后24 h尿量,尿液在4℃以3 000 r/min,離心10 min,去除細胞殘骸和食物殘渣,以自動生化儀檢測尿Na+、尿K+,尿Cl-水平。實驗結(jié)束后,眼靜脈叢采取血樣,剪取大鼠左右腎臟組織及膀胱組織,4℃PBS漂洗后裝入編碼容器內(nèi),放入-70℃冰箱中以備用。

1.2.3 總RNA提取,cDNA制備及RT-PCR實驗:取大鼠腎臟髓質(zhì)約10 0mg及膀胱約50 mg,Trizol法提取總RNA,以TIANGEN公司cDNA第一鏈合成試劑盒制備cDNA。RTPCR實驗條件為,變性,94℃,20s;退火,60℃,20 s;延伸,68℃,33 s。AQP2(174 bp)引物參考文獻[2],AQP2 sense,TTGCAGGAACCAGAC ACTTG;antisense,GCGGAGACGAGCACTTT TAC;β-actin(150bp)為參比基因。

2 結(jié) 果

2.1 澤瀉水提物對正常大鼠尿量影響

1次給藥后,澤瀉水提物 100 mg/kg,500 mg/kg劑量在1 h內(nèi)有明顯利尿作用,所有澤瀉水提物在6 h后均可產(chǎn)生顯著的利尿效應,尿量與呋塞米10 mg/kg組比較并無顯著性差異(圖1)。給藥8 d后,澤瀉水提物有顯著性利尿效果,尿量與呋塞米10 mg/kg組比較,無顯著性差異。

圖1 各組大鼠24 h內(nèi)尿量比較

2.2 澤瀉水提物對正常大鼠尿液Na+,K+和Cl-濃度的影響

1次給藥及8次給藥后,澤瀉水提物可顯著提高大鼠尿Na+,尿K+和尿Cl-水平,并且澤瀉組大鼠尿Na+,尿K+和尿Cl-水平均高于呋塞米10 mg/kg組,尤以8次給藥后更加明顯(見表1,2)。

表1 各組大鼠給藥8 d后尿量及尿液Na+,K+和Cl-濃度比較( ±s,n=6)

表1 各組大鼠給藥8 d后尿量及尿液Na+,K+和Cl-濃度比較( ±s,n=6)

與生理鹽水組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與呋塞米10 mg/kg組比較,#P<0.05,##P<0.01。

組別 尿量(mL)Na+(mmol/L)K+(mmol/L)Cl-(mmol/L)生理鹽水組 21.52±1.30 89.78±5.35 82.23±15.75 125.46±39.71呋塞米10 mg/kg組 29.30±3.13＊＊ 112.18±4.26＊＊ 93.80±6.91 163.76±6.72＊＊澤瀉100 mg/kg組 24.85±2.25＊ 123.65±2.75＊＊## 112.24±5.74＊## 185.63±2.92＊＊##澤瀉500 mg/kg組 25.85±1.96＊ 112.31±3.63＊ 102.94±5.75＊ 171.04±3.41＊＊#澤瀉1 000 mg/kg組 29.17±3.15＊＊ 135.76±3.46＊## 133.01±2.52＊＊## 220.61±5.91＊＊##

表2 各組大鼠1次給藥后尿液Na+,K+和Cl-的濃度比較( ±s,n=6)

表2 各組大鼠1次給藥后尿液Na+,K+和Cl-的濃度比較( ±s,n=6)

與生理鹽水組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與呋塞米10 mg/kg組比較,#P<0.05。

組別 Na+(mmol/L)K+(mmol/L)Cl-(mmol/L)生理鹽水組 89.08±9.12 80.78±16.20 130.61±23.01呋塞米10 mg/kg組 123.24±19.10＊ 102.13±8.92＊ 182.23±24.58＊澤瀉100 mg/kg組 126.25±8.37＊＊ 112.05±24.62＊ 186.83±16.56＊＊澤瀉500 mg/kg組 123.34±6.77＊＊ 112.32±20.95＊ 183.23±29.45＊澤瀉1 000 mg/kg組 135.41±11.53＊＊ 120.85±11.25＊＊# 201.55±27.35＊＊

2.3 澤瀉水提物對對正常大鼠腎臟髓質(zhì)AQP2 mRNA影響

分別以RT-PCR方法檢測大鼠腎臟髓質(zhì)及膀胱組織中AQP2mRNA表達情況,結(jié)果顯示可在腎臟髓質(zhì)組織中檢測到AQP2 RT-PCR產(chǎn)物,在膀胱組織中不能檢測到AQP2 RT-PCR產(chǎn)物,故本實驗檢測腎臟髓質(zhì)AQP2 mRNA表達(圖2)。澤瀉水提物及呋塞米10 mg/kg組大鼠AQP2 mRNA相對表達含量與生理鹽水組比較,明顯下降,差異有顯著性差異(P<0.05或P<0.01),見圖3。

圖2 膀胱、腎臟髓質(zhì)AQP2 RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

圖3 各組大鼠腎臟髓質(zhì)AQP2 mRNA相對含量表達

2.4 肌酐清除率

各組大鼠血肌酐清除率與生理鹽水組比較結(jié)果顯示,差異無顯著性差異,P>0.05。

3 討 論

本實驗采用Kau法篩選利尿合格大鼠,Kau法是1984年Kau對Aston法進行改進[3]提出的大鼠利尿篩選方法,Kau法樣本少、易重復、實驗周期長,更適合中藥藥理學的研究。利尿有兩種影響因素,即增加尿量或電解質(zhì)缺失[4],對照藥呋塞米可以增加尿量,通過抑制Na+/K+/2Cl-轉(zhuǎn)運子增加尿Na+排出。

對于水飽和大鼠,單次及連續(xù)8次給藥均可以顯著增加大鼠尿量,增加大鼠尿Na+,尿K+和尿Cl-水平。本實驗中,連續(xù)給予8次呋塞后,大鼠尿K+與生理鹽水組比較,升高趨勢明顯,但不具統(tǒng)計差異,原因可能是實驗動物數(shù)量不足。據(jù)實驗中觀察及大鼠血清肌酐清除率水平,在實驗的8 d中,澤瀉未表現(xiàn)出明顯的毒性。

AQP2存在于腎臟集合管的主細胞中,參與調(diào)節(jié)尿液的生成[5-6]。AQP2為ADH依賴型水通道蛋白,ADH對主細胞管腔膜AQP2調(diào)節(jié)是通過細胞內(nèi)介導物質(zhì)環(huán)腺苷酸(cAMP)進行的,cAMP能夠激活胞漿內(nèi)蛋白激酶釋放出各種蛋白酶物質(zhì),并轉(zhuǎn)而作用于胞漿與管腔膜上的磷酸蛋白,通過細胞骨骼微管與微絲的功能活動使胞漿內(nèi)AQP2小泡與管腔膜融合,小泡膜上AQP2嵌入管腔膜,極大地提高了管腔膜水通道蛋白數(shù)量和管腔膜水滲透通透性,當腎髓質(zhì)集合管內(nèi)外存在顯著滲透濃度差時,就極大地提高了集合管對水的重吸收[7-8]。連續(xù)給予大鼠8次澤瀉水提物后,可顯著降低其AQP2 mRNA含量表達。值得一提的是,澤瀉100 mg/kg劑量組大鼠 AQP2 mRNA相對表達含量下降幅度最大。

實驗提示澤瀉水提物可顯著增加大鼠尿量,增加大鼠Na+,尿K+和尿Cl-水平,具顯著利尿活性,其利尿活性可能為通過調(diào)節(jié)降低腎臟髓質(zhì)AQP2表達產(chǎn)生。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草(精選本下冊)[M].上海:上海科技出版社,1998:1993.

[2]Zhang G,Zeng X,Han L,et al.Diuretic activity and kidney medulla AQP1,AQP2,AQP3,V2R expression of the aqueous extract of sclerotia of Polyporusumbellatus FRIES in normal rats[J].J Ethnopharmacol,2010,128(2):433.

[3]Kau ST,Keddie JR,Andrews D.A method for screening diuretic agents in the rat[J].J Pharmacol Methods,1984,11(1):67.

[4]王登平.慢性心力衰竭合并低鈉血癥 40例的治療[J].海南醫(yī)學院學報,2006,12(6):526.

[5]陳俠,黃中新.水通道蛋白在急性實驗染毒大鼠腎臟的表達及意義[J].解剖學研究,2010,32(2):110.

[6]Xie L,Hoffert JD,Chou CL,et al.Quantitative analysis of aquaporin-2 phosphorylation[J].American Journal of Physiology,2010,298(2):1018.

[7]Hasler U,Mordasini D,Bens M,et al.Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells[J].J Biol Chem,2002,277(12):10379.

[8]崔成國,赫惠新,潘紹惠,等.AQP1、AQP2及AQP3在人睪丸腫瘤組織中表達的檢測[J].2007,2(5):36.