雌二醇對(duì)老年雌鼠內(nèi)分泌免疫功能調(diào)節(jié)的影響實(shí)驗(yàn)研究

田 莉

(陜西省婦幼保健院輔助生殖中心,陜西西安,710003)

婦女在更年期,由于卵巢功能衰退,合成與分泌的雌激素、孕激素日趨減少,植物神經(jīng)調(diào)節(jié)功能漸失平衡,免疫功能下降,各個(gè)器官、神經(jīng)系統(tǒng)的衰老等引起人體一系列生理與心理的改變[1]。雌二醇是雌激素中生物活性最強(qiáng)的一種,可反映女性卵巢功能,雌二醇的分泌受垂體前葉分泌的促性腺激素激活,體內(nèi)雌激素水平對(duì)下丘腦控制的促性腺激素的生成進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié),影響內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用,導(dǎo)致免疫功能發(fā)生變化[2]。基于神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)理論,筆者探討雌二醇對(duì)內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用,闡述其治療更年期綜合征的藥理作用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑:雌二醇購(gòu)自蘇瑞醫(yī)藥化工有限公司,生化試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD大鼠,雌性,按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和給藥:取3月齡雌性SD大鼠10只設(shè)為青年對(duì)照組,15月齡雌性SD老年大鼠20只,分為空白對(duì)照組、雌二醇給藥組,每組10只,分籠飼養(yǎng)。雌二醇組每天給藥量為1 mg/kg(相當(dāng)于臨床成人每公斤體重劑量的5倍);空白對(duì)照組灌生理鹽水,給藥時(shí)間為3個(gè)月。各組大鼠于3個(gè)月后處死,取血清、脾臟按實(shí)驗(yàn)要求保存。

1.2.2 激素測(cè)定:檢測(cè)大鼠血清雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素(LH)水平,采用RIA法測(cè)定。

1.2.3 T細(xì)胞亞群檢測(cè)[3]:取脾臟組織置于生理鹽水中,機(jī)械法制備細(xì)胞懸液2 mL,加淋巴細(xì)胞分離液2 mL,分離細(xì)胞,取單核粒細(xì)胞層,調(diào)整細(xì)胞濃度為 4×106個(gè)/mL。取 100 μ L懸液,加羊抗大鼠CD4-PE、CD8-FITC(Pharmingen公司生產(chǎn))各20 μ L,避光,室溫孵育 20 min,加2 mL PBS離心,棄去上清,500 μ L PBS液上流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司生產(chǎn)FACS Calibur型)檢測(cè),激發(fā)波488 nm氬離子激光器,在560 nm條件下,經(jīng)FL1、FL2通道以對(duì)數(shù)方式分別獲取信號(hào),信號(hào)的獲取及分析在軟件Cellquest支持下完成。

1.2.4 T淋巴細(xì)胞凋亡的檢測(cè)[3]:取脾臟組織,迅速用70%乙醇固定,24 h后用pH 7.4的PBS洗去乙醇,機(jī)械法制成細(xì)胞懸液,離心濾液,棄去上清液,調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106個(gè)/mL,取100 μ L懸液加濃度為 10 μ g/mL 的 RNA 酶 500 μ L,消化 RNA 30 min,再加 50 μ g/mL PI(Sigma 公司生產(chǎn))500 μ L,避光,室溫孵育20 min流式細(xì)胞儀檢測(cè),方法同上。

2 結(jié) 果

2.1 雌二醇對(duì)老年大鼠E2、FSH、LH水平的影響

如表1所示,與青年對(duì)照組比較,老年大鼠空白組E2水平顯著下降,FSH、LH水平上升;而經(jīng)雌二醇治療后,E2水平上升,FSH、LH水平下降差異有顯著性,比較接近青年對(duì)照組水平,說(shuō)明雌二醇對(duì)內(nèi)分泌失調(diào)具有一定的調(diào)節(jié)作用。

表1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平( ±s)

表1 各組大鼠血清E2、FSH、LH水平( ±s)

注:與青年對(duì)照組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與空白組比較,P<0.05,P<0.01

組別 n E2(ng/L)FSH(mIU/mL)LH(mIU/mL)青年對(duì)照組 10 28.10±0.85 2.37±0.48 2.41±0.51空白組 10 14.65±0.64＊＊ 17.43±3.17＊＊ 3.85±0.43＊雌二醇組 10 21.34±0.74 8.47±2.15 2.86±0.75

2.2 雌二醇對(duì)老年大鼠CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值的影響

如表2所示,青年對(duì)照組比較,老年大鼠空白組CD4+、CD4+/CD8+顯著下降,CD8+上升;而雌二醇治療后與空白對(duì)照比較,CD4+、CD4+/CD8+上升,CD8+下降差異有顯著性,比較接近青年對(duì)照組水平。雌二醇可增加脾臟CD4+,使CD4+/CD8+升高調(diào)整已經(jīng)異常的淋巴細(xì)胞亞群,延緩免疫功能衰老,以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

2.3 雌二醇對(duì)老年大鼠脾臟T細(xì)胞凋亡率的影響

如表2所示,青年對(duì)照組比較,老年大鼠空白組T細(xì)胞凋亡率顯著上升;而雌二醇治療后與空白對(duì)照比較,T細(xì)胞凋亡率顯著下降,差異有顯著性意義,比較接近青年對(duì)照組水平。提示雌二醇可降低脾臟淋巴細(xì)胞的凋亡率,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。

表2 各組大鼠脾臟T細(xì)胞亞群及細(xì)胞凋亡( ±s)

表2 各組大鼠脾臟T細(xì)胞亞群及細(xì)胞凋亡( ±s)

注:與青年對(duì)照組比較,＊P<0.05,＊＊P<0.01;與空白組比較,P<0.05,P<0.01

組別 n CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+ T細(xì)胞凋亡率(%)青年對(duì)照組 10 64.18±2.43 18.75±3.91 3.71±0.82 12.56±0.98空白組 10 48.53±1.75＊＊ 35.61±3.24＊＊ 1.51±0.42＊ 25.61±0.74＊雌二醇組 10 53.65±3.61 28.51±1.78 1.95±0.31 20.54±1.58

3 討 論

本課題著重探討雌二醇對(duì)老年雌性大鼠內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)作用,考慮到大鼠的實(shí)際壽命和生育年限,選用15月齡作為雌性大鼠自然初老模型,與青年期大鼠比較,E2、FSH、LH、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、T細(xì)胞凋亡率存在顯著性差異。表明與青年這一時(shí)期大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫功能方面存在著一定的紊亂,說(shuō)明選用此階段大鼠作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪强尚械摹?/p>

在衰老過(guò)程中,內(nèi)分泌系統(tǒng)的老化表現(xiàn)最為突出,而雌激素分泌的減少又是其中最早最突出的變化之一[4-8]。本實(shí)驗(yàn)雌鼠初老期T細(xì)胞明顯減少,E2水平下降,由于E2分泌的減少,解除了其對(duì)垂體的負(fù)反饋,從而導(dǎo)致了FSH水平的升高;最終導(dǎo)致免疫功下降,內(nèi)分泌調(diào)節(jié)作用出現(xiàn)問(wèn)題。雌二醇可以通過(guò)提高E2分泌量,反饋地抑制FSH的釋放。機(jī)體衰老時(shí),垂體.甲狀腺軸也出現(xiàn)功能減退,由于L、T4水平下降,反饋性地引起垂體TSH的增加,由于下丘腦-垂體-脾臟系統(tǒng)互相影響,導(dǎo)致機(jī)體脾臟功能下降,T細(xì)胞凋亡率增加。雌二醇可以使初老雌性大鼠脾臟功能增強(qiáng),異常的T細(xì)胞恢復(fù),體現(xiàn)其免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能。其具體作用機(jī)理可能與雌二醇調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的合成和分泌有關(guān),如抑制在神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)中起重要介質(zhì)作用的細(xì)胞因子(如IFN-γ、TNF-α、IL-1 等)的釋放[9]。

雌激素作為一個(gè)重要激素伴隨并影響著女性的一生,進(jìn)入老年,卵巢功能衰竭,雌激素水平低落,可誘發(fā)許多疾病,絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥尤其明顯,而雌二醇(E2)是雌激素中分泌最多,作用也最強(qiáng)的一種。絕經(jīng)后E2明顯減少,僅50%的E2對(duì)靶細(xì)胞起作用。Gray等在1987年首先在體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了雌激素受體(ER),雌激素可直接作用于成骨細(xì)胞。有實(shí)驗(yàn)證明:ER的表達(dá)依賴于雌激素的存在。切除卵巢的大鼠的ERmRNA表達(dá)水平明顯降低,而給予雌激素治療者,ERmRNA表達(dá)水平接近正常,這正是對(duì)骨質(zhì)疏松癥婦女應(yīng)用雌激素替代療法的基礎(chǔ)。隨著雌二醇研究機(jī)理的不斷深入,將會(huì)出現(xiàn)更多的雌二醇現(xiàn)代藥物制劑,為婦女更年期綜合征的診治帶來(lái)福音。

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