腎癌組織中TβRⅡ基因甲基化狀態的檢測及其臨床意義

張愛莉,樊 博,趙志紅,倪曉辰

(河北醫科大學第四醫院泌尿外科,河北石家莊,050011)

腎細胞癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一,其中以透明細胞癌最為多見,約占90%。腎癌的發病機制不詳,除遺傳因素外,已知的危險因素還包括吸煙、肥胖、工業及水污染、射線等等。由于起病隱匿,約四分之一的腎癌患者在發現時已發生腫瘤局部或遠處轉移,目前的治療仍以根治性手術為主,但術后復發率達20%以上,且放療、化療效果不佳,因此迫切需要早期診斷方法和其他有效的治療手段。近年來對于腎透明細胞癌(RCCC)的病因和發病機制已進行了多項研究,遺傳學和表遺傳學的改變被認為是主要的分子機制,其中表遺傳學的改變尤其是DNA甲基化是近來研究的熱點。轉化生長因子β受體Ⅱ(TβRⅡ)是一個新的抑癌基因,其表達缺失與多種腫瘤的發生發展密切相關。本項研究以腎透明細胞癌為研究對象,探討TβRⅡ在腎透明細胞癌中的甲基化狀態及其蛋白表達,進一步了解了TβRⅡ在腎透明細胞癌發生、發展中的作用,從而為確定腎透明細胞癌的發病機制和早期生物學診斷提供理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集河北醫科大學第四醫院2008年3月～2009年10月泌尿外科的腎癌手術切除標本,均無淋巴結及遠處轉移。一部分液氮保存用于DNA的提取,另一部分10%甲醛固定用于免疫組化研究。腎癌組織標本均經HE染色證實為透明細胞癌。用于提取DNA的腎透明細胞癌標本43例,男 26例,女17例,其中高中分化 34例,低分化9例,并留取其相應的癌旁組織(距癌邊緣2 cm以上);用于免疫組化研究的腎透明細胞癌標本40例,男23例,女 17例,其中高中分化31例,低分化9例,其中28例取其癌旁組織(距癌邊緣至少2 cm以上)。年齡32～78歲,平均年齡58.6歲。全部患者術前均未接受放射治療和化學治療。

1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、亞硫酸氫鹽、對苯二酚(Sigma-aldrich),蛋白酶K(德國Merck公司產品),目的基因和GAPDH引物、甲基化特異性PCR(methylation specificPCR,MSP)引物(上海捷瑞生物技術有限公司),Trizol試劑(北京賽百盛生物技術有限公司),Wizard DNA純化試劑盒、擴增試劑盒(綠色體系)(Promega公司),TβRⅡ兔多克隆抗體、兔二抗免疫組化試劑盒、DAB顯色液(北京中衫金橋生物技術有限公司)。

1.3 甲基化特異性PCR(MSP)檢測 TβRⅡ基因甲基化

所選標本經常規蛋白酶K消化,采用酚/氯仿抽提法提取癌組織和癌旁正常組織的基因組DNA。每個樣本均取 7 μ g DNA,用 2 mol/L NaOH變性處理[1],于10 mmol/L對苯二酚和3 mol/L亞硫酸氫鈉中52℃反應 16 h,然后用Wizard DNA純化試劑盒純化經亞硫酸氫鈉處理的DNA標本。經亞硫酸氫鹽處理后,DNA中的C轉變為U,而CpG島部位發生甲基化的C則不能發生同樣的改變。同一樣品DNA在亞硫酸氫鹽修飾前后分別用甲基化和非甲基化引物擴增,如修飾前無任何目的條帶擴增而修飾后有目的條帶擴增,則亞硫酸氫鹽修飾完全。PCR反應條件為:95℃預變性12 min,開蓋加Taq酶;然后95℃60 s,52℃(甲基化)/55℃(非甲基化)45 s,72℃40 s,40個循環;最后72℃延伸10 min。每個標本均做甲基化和非甲基化兩種情況的檢測。用甲基化酶(SssI)處理過的的正常人外周血DNA作為甲基化陽性對照,同時用未經SssI處理的外周血DNA作為非甲基化陽性對照,陰性對照用滅菌雙蒸水代替DNA模板進行PCR。相應的甲基化引物、產物大小及退火溫度見表1。

表1 MSP中TβRⅡ基因的引物

1.4 免疫組化檢測RCCC組織中TβRⅡ的蛋白表達

采用P-V法,切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蒸餾水漂洗,3%甲醇過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性,抗原修復,滴加一抗(TβRⅡ濃度按1:100稀釋)4℃過夜,滴加二抗,37℃溫箱內孵育30min。DAB液顯色后,蘇木素復染,常規梯度酒精脫水,封片。同時設置以PBS代替一抗為陰性對照。免疫組化結果分析根據許良中等[2]半定量標準:物鏡下陽性細胞≤10%為1分;10%～50%為2分;50%～75%為3分;>75%為4分。染色強度分數標準:無色為0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。兩類百分數乘積<3分為陰性;滿3分為陽性(+);4分為較強陽性( );>5分為強陽性( )。

2 結 果

2.1 RCCC組和相應的癌旁正常組中TβRⅡ基因甲基化狀態

TβRⅡ基因在RCCC組及癌旁正常組中的甲基化率分別為58.1%(25/43)和34.9%(15/43),差異有統計學意義,RCCC組的甲基化率顯著高于癌旁正常組(χ2=4.674,P=0.031)。見圖1

圖1 RCCC中TβRⅡ基因的甲基化結果

2.2 TβRⅡ基因甲基化與臨床病理因素的關系

TβRⅡ基因在 RCCC組中的甲基化率與年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤分化程度的關系見表2。經統計學分析,TβRⅡ基因甲基化與臨床資料無關。

表2 RCCC中TβRⅡ基因甲基化與臨床病理因素的關系

2.3 RCCC組和相應的癌旁正常組中TβRⅡ基因的蛋白表達情況

TβRⅡ免疫組化染色以細胞質出現片狀或顆粒狀棕黃色著色為陽性。TβRⅡ在腎透明細胞癌組織中低表達或不表達,見圖2,在癌旁正常組織中高表達,見圖 3。40例腎透明細胞癌組織中TβRⅡ陽性表達率為60.00%(24/40),28例癌旁正常組織中陽性表達率為92.86%(26/28),兩者之間差異有統計學意義(P<0.05)。癌組織中TβRⅡ的表達與患者的年齡和性別無關(P>0.05),與腫瘤的大小和分化程度相關(P<0.05)見表3。

表3 RCCC中TβRⅡ基因蛋白表達與臨床病理因素的關系

圖2 TβRⅡ在腎透明細胞癌組織中低表達(IHC 400倍)

圖3 TβRⅡ在癌旁正常組織中高表達(IHC 400倍)

2.4 RCCC中 TβRⅡ蛋白表達與TβRⅡ甲基化之間的關系

在TβRⅡ蛋白表達陽性的RCCC組織中,其甲基化陽性率為70.8%(17/24),在TβRⅡ蛋白表達陰性的 RCCC組織中,其甲基化陽性率為43.8%(7/16),兩者差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

惡性腫瘤的發生是一個多因素、多階段的復雜過程,涉及多種基因和信號傳導通路的異常,近年來人們發現轉化生長因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)信號傳導途徑異常與腫瘤的發生有著密切的聯系。轉化生長因子β(transforming growth factorβ ,TGF-β)作為一種細胞因子,可以調節細胞的生長,分化和胚胎發育,誘導細胞粘附和轉移,促進細胞外基質形成和創傷愈合,參與和介導免疫抑制和炎癥反應等多種人類重要的生理和病理過程[3-4]。而上述作用必須通過與細胞表面的膜受體即轉化生長因子β受體(transforming growth factorβ receptor,TβR)結合才能發揮。其中TβRⅡ在TGF-β信號轉導中作用最為重要,它主要是通過與 TGF-β配體結合,啟動TGF-β信號轉導通路在細胞的信息轉導[3]。目前認為,轉化生長因子β受體是一種抑癌基因,它在細胞表面發揮作用,其突變、缺失及失活對腫瘤的增殖、浸潤和轉移,及預后有重要影響。

研究表明TβRⅡ基因的失活與多種腫瘤的發生有關,除去遺傳學中基因突變與缺失外,普遍認為表遺傳學改變尤其是DNA甲基化是TβRⅡ基因失活而致癌的主要機制。TβRⅡ在胃癌[5-6]、前列腺癌[7-8]、肺癌[9-10]和胰腺癌[11]中的異常甲基化已有報道,但它們在腎癌中的甲基化情況尚未見報道。

本研究中作者發現TβRⅡ在腎透明細胞癌組織中的甲基化率為58.1%,顯著高于癌旁正常組織的34.9%。但是在癌組織中,其甲基化與各臨床病理資料之間沒有相關性,說明TβRⅡ基因甲基化是腎透明細胞癌發生的早期分子事件,與腫瘤的發展和轉移可能無關,所以TβRⅡ基因甲基化還不能作為腎透明細胞癌惡性程度評估和判斷預后的參考指標。TβRⅡ在腎透明細胞癌組織中的免疫組化結果顯示,基因蛋白表達在RCCC組顯著低于癌旁正常組,且其蛋白表達與腫瘤的大小和腫瘤分化程度相關,說明TβRⅡ蛋白水平表達的下調或缺失可能參與了腎透明細胞癌的發生和發展。但是TβRⅡ甲基化陽性率在蛋白表達陽性的RCCC組織與蛋白表達陰性的RCCC組織中差異無統計學意義,究其原因,其一可能是因為在RCCC中,除了甲基化外,可能還有其他一些機制導致蛋白表達的異常,如基因突變、雜合缺失等;其二,可能由于樣本例數的限制,降低了相應的檢驗效能,今后有待于進一步擴大樣本例數以明確甲基化與蛋白表達的相關性。

本研究結果顯示TβRⅡ基因啟動子區的高甲基化與腎透明細胞癌的發生有關,為腎透明細胞癌的早期診斷提供了分子參考指標,同時可以用去甲基化藥物對這些位點進行干預,以便對腎透明細胞癌進行早期預防和治療。對TβRⅡ及它與腫瘤相關性的深入研究將有助于我們進一步揭示腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移機制,找到抑制腫瘤的靶點或預測腫瘤患者預后的分子指標。

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