前列腺干細胞抗原特異性MR分子探針體外成像實驗研究

任 靜，楊 勇，王 芳，魏光全，葛雅麗，常英娟，楊安鋼，宦 怡*

近年來前列腺癌(prostatic cancer, PCa)在我國發(fā)病率逐年上升[1]，分子影像學(molecular imaging)的發(fā)展為PCa診斷及治療開辟了新的領(lǐng)域[2]。前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)是PCa的腫瘤標志物之一[3]；納米金磁微粒是一種具有Fe3O4/Au核/殼結(jié)構(gòu)的納米微粒，它既具有超順磁性又具備膠體金的特點，可以通過簡便的方法偶聯(lián)微量抗體[4]。本實驗室首次以金磁微粒作為MR對比劑標記抗人PSCA單抗7F5，構(gòu)建了PCa特異性MR分子探針7F5@GoldMag，本文擬重點探討該特異性分子探針在體外MR成像檢測前列腺癌細胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

細胞：前列腺癌PC-3細胞株由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院泌尿外科提供，對照組人肝癌細胞株SMMC-7721由本實驗室保存。

主要試劑：實驗組PSCA特異性分子探針7F5@GoldMag及對照組小鼠抗人非特異性抗體IgG@GoldMag均由本實驗室制備并保存；RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶(Sigma公司，USA)，GoldMagTM-CS納米金磁微粒抗體固定化試劑盒(陜西西大北美基因股份有限公司)。

主要設(shè)備：SHEL-LAB CO2孵箱(美國Shelton機械制造公司)、磁共振成像系統(tǒng)(Siemens Magnetom trio#tim 3.0T，德國)。

1.2 實驗方法

細胞培養(yǎng)：在37℃、5%CO2濃度條件孵箱中培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)液。待細胞長至80%時，顯微鏡下觀察細胞生長良好，倒去培養(yǎng)液，0.1% PBS液清洗一遍，加入0.1%胰蛋白酶約3 ml，顯微鏡下觀察細胞皺縮變圓后加入4 ml新鮮培養(yǎng)液，吹打均勻，吸出移入離心管，800rpm離心5 min，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液吹打至懸浮，1∶3傳代，標記后放恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

GoldMagTM-CS納米金磁微粒用于MR成像的可行性：將金磁微粒原液(5mg/mL)100μL以1%瓊脂糖凝膠倍比稀釋(1∶40～1∶1280)混勻后置入1.5 ml離心管，標記，放置于4℃環(huán)境下至凝膠凝固；另取PBS分別加入1.5 ml離心管，放入特制試管架，MR成像。掃描參數(shù)： T2WI：TR 4000ms/TE 90ms，層厚2 mm，F(xiàn)OV 120mm。

7F5@GoldMag體外標記前列腺癌細胞：PC-3和SMMC-7721細胞分別與7F5@GoldMag、無關(guān)抗體@GoldMag交叉配對；將兩種細胞分別接種于100mm培養(yǎng)皿，細胞鋪滿皿底約80%時棄去培養(yǎng)液，PBS漂洗3次；7F5@GoldMag及無關(guān)抗體@GoldMag(金磁微粒1 mg/ml，抗體濃度約60μg/ml)各取 2 ml，加入相應PC-3和SMMC-7721培養(yǎng)皿內(nèi)；同時加入50μL羊血清；37℃孵育1 h；PBS漂洗5 min×3次；細胞刮刀刮取細胞，PBS沖洗后收集細胞，800rpm離心6 min；按實驗分組將細胞團塊與1%瓊脂糖凝膠混勻注入1.5 ml離心管，分組標記(a: PC-3＋7F5@GoldMag；b: PC-3＋無關(guān)抗體@GoldMag；c: SMMC-7721＋7F5@GoldMag；d:SMMC-7721＋無關(guān)抗體@GoldMag)，4℃放置至凝膠凝固。

MR體外成像：在分別裝有以上四組細胞凝膠的1.5 ml離心管分別加入PBS，置于充滿PBS的4 ml試管內(nèi)，放入特制試管架，行MR軸位及冠狀位成像，掃描參數(shù)：T2WI：TR 4000ms/TE 90ms，層厚2 mm，F(xiàn)OV 120mm。

1.3 統(tǒng)計學方法

對所得圖像測定信號強度，每個感興趣區(qū)包括40(5×8)個像素，采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件包，各組間信號差異比較用單因素方差分析，P＜0.05認為結(jié)果有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GoldMagTM-CS納米金磁微粒用于MR成像的結(jié)果

圖1 不同濃度GoldMagTM-CS納米金磁微粒T2WI圖像Fig.1 T2WI of GoldMagTM-CS nanoparticles in different saturation

圖2 不同濃度金磁微粒T2WI信號強度箱圖比較Fig.2 Boxplot showed comparisons of T2WI signal intensity of GoldMagTM-CS nanoparticles in different saturation

不同濃度GoldMagTM-CS納米金磁微T2WI 序列MR成像結(jié)果見圖1，其信號差異比較統(tǒng)計學結(jié)果見圖2，GoldMagTM-CS稀釋至1∶640與1%瓊脂糖凝膠相比，T2WI序列信號強度差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。

2.2 7F5@GoldMag作用于前列腺癌細胞體外MR成像結(jié)果

7F5@GoldMag標記PC-3細胞(管a)T2WI信號強度明顯降低，標記的SMMC-7721細胞(管c)信號強度無降低；而無關(guān)抗體@GoldMag標記的兩種細胞(管b、d)信號強度均無降低(見圖3)。

圖3 T2WI各試管軸位及冠狀位掃描，各試管依次為a:PC-3＋7F5@GoldMag，b: PC-3＋無關(guān)抗體@GoldMag，c: SMMC-7721＋7F5@GoldMag，d: SMMC-7721＋無關(guān)抗體@GoldMag。管a信號強度明顯降低Fig.3 T2WI of the tubes (a: PC-3 +7F5@GoldMag,b: PC-3 + non-related IgG @GoldMag, c: SMMC-7721 + 7F5@GoldMag, d: SMMC-7721 + non-related IgG@GoldMag), T2 signal intensity of tube a showed signi fi cantly decrease.

2.3 各組細胞MR信號強度差異的統(tǒng)計學分析

管a、b之間信號差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；管b、c、d之間信號差異無統(tǒng)計學意義(P=0.618)(見圖4)。

3 討論

3.1 MR分子影像探針構(gòu)建策略

分子影像探針是指對某一特定生物分子(如蛋白質(zhì)、DNA、RNA)具有特異性、靶向性并能夠進行體內(nèi)和/或體外示蹤的標記化合物分子，它能夠在體和/或離體反映靶生物分子的量和/或功能。目前，MR分子成像以其高分辨率及成像參數(shù)的多元性而被大多數(shù)學者認為是最理想的分子影像學技術(shù)之一[5]，具有非常好的前景，但其敏感度相對較差。靶向性MR分子探針由與靶具有高親和力的配體(如抗體、肽或小分子化合物)經(jīng)特定的方法與順磁性對比劑連接構(gòu)成，利用靶特異性探針與靶目標直接結(jié)合而成像[6]。目前亟需研究開發(fā)新型分子探針，使MR不僅具有極高的空間分辨力，還具有較高的敏感性。

圖4 各組細胞T2WI信號強度箱圖比較Fig.4 Boxplot showed comparisons of T2WI signal intensity of the tubes (a: PC-3 + 7F5@GoldMag, b:PC-3 + non-related IgG @GoldMag, c: SMMC-7721 +7F5@GoldMag, d: SMMC-7721 + non-related IgG@GoldMag).

3.2 納米金磁微粒及其對MR信號的影響

納米金磁微粒是具有Fe3O4(核)/Au(殼)結(jié)構(gòu)的復合超順磁性納米微粒[4]，本實驗首次采用直徑50nm的金磁微粒作為MR信號組件，其Fe3O4核直徑約20nm，金殼厚度約15 nm，其創(chuàng)新點在于將氧化鐵納米微粒用金殼來包被，使其既具有超順磁性，又具有膠體金的性質(zhì)[7]，從而通過表面靜電作用、疏水相互作用、蛋白氨基酸殘基側(cè)鏈的巰基與金的作用等[7-9]將其與單抗偶聯(lián)，可最大限度保留被偶聯(lián)分子的生物活性，同時操作簡便，抗體固定化效率高。與其他MR對比劑相比，優(yōu)勢明顯。它本質(zhì)上仍屬于SPIO范疇，對MR信號的影響也主要表現(xiàn)為產(chǎn)生較強的T2負性對比，因此本實驗的MR掃描序列以T2WI為主。在操作中將金磁微粒以1%瓊脂糖凝膠倍比稀釋后4℃放置至凝膠凝固，主要是為了避免金磁微粒沉淀引起的信號不均勻現(xiàn)象。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，稀釋至1∶640的金磁微粒T2WI信號強度仍顯著低于1%瓊脂糖凝膠(P=0.000)。更低濃度的金磁微粒對MR信號影響輕微。金磁微粒在臨床應用的3.0T場強MR掃描儀條件下具備作為對比劑的條件，基于這一結(jié)果，可以認為以金磁微粒作為對比劑所構(gòu)建的探針能夠應用于MR成像。

3.3 7F5@GoldMag對前列腺癌細胞體外MR信號的影響

用高親和力分子探針來辨認和證實相關(guān)受體是分子成像的先決條件。我們用抗人PSCA單抗7F5與納米金磁微粒偶聯(lián)構(gòu)建前列腺癌特異性分子探針7F5@GoldMag，將其與PC-3細胞孵育，行MR掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它可特異性降低PC-3細胞的T2WI信號強度，對SMMC-7721細胞T2WI信號無明顯影響。利用類似方法檢測無關(guān)抗體@GoldMag對兩種細胞T2WI信號強度均無明顯影響。7F5@GoldMag與PSCA陽性細胞PC-3的特異性結(jié)合是其作為前列腺癌特異性分子探針的基礎(chǔ)。

本實驗結(jié)果表明，以PSCA為靶向分子的MR探針7F5@GoldMag用于體外前列腺癌細胞MR成像，可特異性降低PC-3細胞的T2WI信號，從而為下一步體內(nèi)MR成像實驗奠定了基礎(chǔ)。

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